Hematologiczne analizatory krwi to konie robocze laboratoriów klinicznych. Te wysokowydajne instrumenty zapewniają wiarygodne zliczanie krwinek czerwonych, płytek krwi i 5-składnikowych krwinek białych, które identyfikują limfocyty, monocyty, neutrofile, eozynofile i bazofile. Liczba erytrocytów jądrowych i niedojrzałych granulocytów to szósty i siódmy wskaźnik. Chociaż impedancja elektryczna nadal ma zasadnicze znaczenie dla określenia całkowitej liczby i wielkości komórek, techniki cytometrii przepływowej okazały się przydatne w różnicowaniu leukocytów i badaniu krwi w analizatorze patologii hematologicznej.
Ewolucja analizatora
Pierwsze automatyczne mierniki ilościowe krwi wprowadzone w latach 50. XX wieku były oparte na zasadzie impedancji elektrycznej Coultera, w którejkomórki, przechodząc przez mały otwór, przerwały obwód elektryczny. Były to „prehistoryczne” analizatory, które tylko liczyły i obliczały średnią objętość erytrocytów, średnią hemoglobinę i jej średnią gęstość. Każdy, kto kiedykolwiek policzył komórki, wie, że jest to bardzo monotonny proces, a dwóch asystentów laboratoryjnych nigdy nie da takiego samego wyniku. Tym samym urządzenie wyeliminowało tę zmienność.
W latach 70. na rynek weszły zautomatyzowane analizatory, które były w stanie określić 7 parametrów krwi i 3 składniki formuły leukocytów (limfocyty, monocyty i granulocyty). Po raz pierwszy ręczne liczenie leukogramów zostało zautomatyzowane. W latach 80. jedno narzędzie mogło już obliczyć 10 parametrów. W latach 90. nastąpiła dalsza poprawa różnic leukocytów przy użyciu metod przepływu opartych na impedancji elektrycznej lub właściwościach rozpraszania światła.
Producenci analizatorów hematologicznych często starają się oddzielić swoje instrumenty od produktów konkurencji, skupiając się na konkretnym pakiecie stosowanych technologii różnicowania białych krwinek lub liczenia płytek krwi. Jednak eksperci od diagnostyki laboratoryjnej twierdzą, że większość modeli jest trudna do odróżnienia, ponieważ wszystkie wykorzystują podobne metody. Po prostu dodają dodatkowe funkcje, aby wyglądały inaczej. Na przykład jeden automatyczny analizator hematologiczny może określić różnice w leukocytach poprzez umieszczenie barwnika fluorescencyjnego w jądrze.komórki i pomiary jasności jarzenia. Drugi może zmieniać przepuszczalność i rejestrować szybkość wchłaniania barwnika. Trzecia jest w stanie zmierzyć aktywność enzymu w komórce umieszczonej w określonym podłożu. Istnieje również metoda przewodnictwa wolumetrycznego i rozpraszania, która analizuje krew w stanie „prawie naturalnym”.
Nowe technologie zmierzają w kierunku metod przepływowych, w których komórki są kolejno badane przez system optyczny, który może mierzyć wiele parametrów, których nigdy wcześniej nie mierzono. Problem w tym, że każdy producent chce stworzyć własną metodę, aby zachować swoją tożsamość. Dlatego często wyróżniają się w jednym obszarze i pozostają w tyle w innym.
Bieżący stan
Według ekspertów wszystkie analizatory hematologiczne na rynku są ogólnie wiarygodne. Różnice między nimi są niewielkie i dotyczą dodatkowych funkcji, które niektórym mogą się podobać, a niektórym nie. Jednak decyzja o zakupie instrumentu zwykle zależy od jego ceny. Podczas gdy koszty nie były problemem w przeszłości, dziś hematologia staje się bardzo konkurencyjnym rynkiem i czasami ceny (zamiast najlepszej dostępnej technologii) wpływają na zakup analizatora.
Najnowsze modele o wysokiej wydajności mogą być używane jako samodzielne narzędzie lub jako część zautomatyzowanego systemu wielonarzędziowego. W pełni zautomatyzowane laboratorium obejmuje analizatory hematologiczne, chemiczne i immunochemiczne z automatycznymi wejściami, wyjściami i chłodzeniemustawienia.
Narzędzia laboratoryjne zależą od badanej krwi. Jego różne typy wymagają specjalnych modułów. Analizator hematologiczny w weterynarii jest skonfigurowany do pracy z jednolitymi elementami różnych gatunków zwierząt. Na przykład ProCyte Dx firmy Idexx może badać próbki krwi psów, kotów, koni, byków, fretek, królików, myszoskoczków, świń, świnek morskich i świnek miniaturowych.
Stosowanie zasad przepływu
Analizatory są porównywalne w niektórych obszarach, a mianowicie w określaniu poziomu leukocytów i erytrocytów, hemoglobiny i płytek krwi. To zwykłe, typowe wskaźniki, w dużej mierze takie same. Ale czy analizatory hematologiczne są dokładnie takie same? Oczywiście nie. Niektóre modele są oparte na zasadach impedancji, niektóre wykorzystują rozpraszanie światła laserowego, a inne wykorzystują fluorescencyjną cytometrię przepływową. W tym ostatnim przypadku stosuje się barwniki fluorescencyjne, które barwią unikalne cechy komórek, dzięki czemu można je rozdzielić. W ten sposób staje się możliwe dodanie dodatkowych parametrów do formuł leukocytów i erytrocytów, w tym zliczanie liczby erytrocytów jądrzastych i niedojrzałych granulocytów. Nowym wskaźnikiem jest poziom hemoglobiny w retikulocytach, który służy do monitorowania erytropoezy i frakcji niedojrzałych płytek krwi.
Postęp w technologii zaczyna zwalniać w miarę pojawiania się całych platform hematologicznych. Wciąż są nadalliczne ulepszenia. Obecnie prawie standardem jest pełna morfologia krwi z liczbą erytrocytów jądrzastych. Ponadto wzrosła dokładność zliczania płytek krwi.
Inną standardową funkcją analizatorów wysokiego poziomu jest określenie liczby komórek w płynach biologicznych. Liczenie liczby leukocytów i erytrocytów to żmudna procedura. Jest zwykle wykonywany ręcznie na hemocytometrze, jest czasochłonny i wymaga wykwalifikowanego personelu.
Kolejnym ważnym krokiem w hematologii jest określenie formuły leukocytów. Jeśli wcześniejsze analizatory mogły oznaczać jedynie komórki blastyczne, niedojrzałe granulocyty i atypowe limfocyty, to teraz istnieje potrzeba ich liczenia. Wielu analityków wymienia je w formie wskaźnika badawczego. Ale większość dużych firm nad tym pracuje.
Nowoczesne analizatory dostarczają dobrych informacji ilościowych, ale nie jakościowych. Są dobre do liczenia cząstek i mogą je klasyfikować jako czerwone krwinki, płytki krwi, białe krwinki. Są jednak mniej wiarygodne w szacunkach jakościowych. Na przykład analizator może określić, że jest to granulocyt, ale nie będzie tak dokładny w określaniu jego etapu dojrzewania. Następna generacja instrumentów laboratoryjnych powinna być w stanie lepiej to mierzyć.
Dziś wszyscy producenci udoskonalili technologię zasady impedancji Coulter i dostroili swoje oprogramowanie do punktu, w którym mogą wydobyć jak najwięcej danych. W przyszłości nowetechnologie wykorzystujące funkcjonalność komórki, a także syntezę jej białka powierzchniowego, co wskazuje na jej funkcje i etap rozwoju.
Granica cytometrii
Niektóre analizatory wykorzystują metody cytometrii przepływowej, w szczególności markery antygenowe CD4 i CD8. Najbliżej tej technologii są analizatory hematologiczne Sysmex. Ostatecznie nie powinno być między nimi żadnej różnicy, ale to wymaga, aby ktoś dostrzegł przewagę.
Oznaką możliwej integracji jest to, że to, co uważano za standardowe testy, które przeszły do cytometrii przepływowej, powraca w hematologii. Na przykład nie byłoby zaskakujące, gdyby analizatory mogły przeprowadzać liczbę płodowych krwinek czerwonych, zastępując ręczną technikę testu Kleinhauera-Bethkego. Badanie można wykonać za pomocą cytometrii przepływowej, ale jego powrót do laboratorium hematologicznego da mu szerszą akceptację. Jest prawdopodobne, że na dłuższą metę ta fatalna analiza pod względem dokładności będzie bardziej zgodna z tym, czego należy oczekiwać od diagnostyki w XXI wieku.
Granica między analizatorami hematologicznymi a cytometrami przepływowymi prawdopodobnie ulegnie zmianie w przewidywalnej przyszłości wraz z postępem technologii lub metodologii. Przykładem jest liczba retikulocytów. Zostało to najpierw wykonane ręcznie, a następnie na cytometrze przepływowym, po czym stało się narzędziem hematologicznym, gdy technika została zautomatyzowana.
Perspektywy integracji
Według ekspertów, kilka prostychtesty cytometryczne mogą być przystosowane do analizatora hematologicznego. Oczywistym przykładem jest wykrywanie regularnych podzbiorów limfocytów T, bezpośredniej przewlekłej lub ostrej białaczki, gdzie wszystkie komórki są jednorodne o bardzo wyraźnym profilu fenotypowym. W analizatorach krwi można dokładnie określić charakterystykę rozpraszania. Przypadki mieszanych lub naprawdę małych populacji o nietypowych lub bardziej odbiegających od normy profilach fenotypowych mogą być bardziej złożone.
Jednak niektórzy ludzie wątpią, czy hematologiczne analizatory krwi staną się cytometrami przepływowymi. Standardowy test kosztuje znacznie mniej i powinien pozostać prosty. Jeżeli w wyniku jego postępowania zostanie ustalone odchylenie od normy, konieczne jest poddanie się innym testom, ale klinika lub gabinet lekarski nie powinny tego robić. Jeśli złożone testy są przeprowadzane osobno, nie zwiększą kosztów normalnych. Eksperci są sceptyczni, czy badania przesiewowe w kierunku złożonej ostrej białaczki lub duże panele stosowane w cytometrii przepływowej szybko powrócą do laboratorium hematologicznego.
Cytometria przepływowa jest droga, ale istnieją sposoby na obniżenie kosztów poprzez łączenie odczynników na różne sposoby. Innym czynnikiem, który spowalnia integrację testu z analizatorem hematologicznym, jest utrata przychodów. Ludzie nie chcą stracić tego biznesu, ponieważ ich zyski już się zmniejszyły.
Ważne jest również rozważenie rzetelności i odtwarzalności wyników analizy przepływu. Metody oparte naimpedancji, to konie robocze w dużych laboratoriach. Muszą być niezawodne i szybkie. I musisz się upewnić, że są opłacalne. Ich siła tkwi w dokładności i powtarzalności wyników. A ponieważ pojawiają się nowe zastosowania w dziedzinie cytometrii komórkowej, wciąż wymagają one sprawdzenia i wdrożenia. Technologia in-line wymaga dobrej kontroli jakości i standaryzacji przyrządów i odczynników. Bez tego możliwe są błędy. Ponadto konieczne jest posiadanie przeszkolonego personelu, który wie, co robi i pracuje.
Według ekspertów pojawią się nowe wskaźniki, które zmienią hematologię laboratoryjną. Instrumenty, które mogą mierzyć fluorescencję, znajdują się w znacznie lepszej pozycji, ponieważ mają wyższy stopień czułości i selektywności.
Oprogramowanie, reguły i automatyzacja
Podczas gdy wizjonerzy patrzą w przyszłość, producenci zmuszeni są dziś walczyć z konkurencją. Oprócz podkreślania różnic w technologii, firmy różnicują swoje produkty za pomocą oprogramowania, które zarządza danymi i zapewnia automatyczną walidację normalnych komórek w oparciu o zestaw reguł ustalonych w laboratorium, znacznie przyspieszając walidację i dając personelowi więcej czasu na skupienie się na nietypowych przypadkach..
Na poziomie analizatora trudno jest rozróżnić zalety różnych produktów. W pewnym stopniu posiadanie oprogramowania, które odgrywa kluczową rolę w uzyskiwaniu wyników analizy, pozwala wyróżnić się produktowi na rynku. Przede wszystkim firmy diagnostyczne udają się dorynkowe oprogramowanie do ochrony ich działalności, ale potem zdają sobie sprawę, że systemy zarządzania informacjami są niezbędne do ich przetrwania.
Z każdą generacją analizatorów oprogramowanie znacznie się poprawia. Nowa moc obliczeniowa zapewnia znacznie lepszą selektywność w ręcznym obliczaniu wzoru leukocytów. Bardzo ważna jest możliwość ograniczenia nakładu pracy z mikroskopem. Jeśli istnieje dokładny instrument, wystarczy zbadać komórki patologiczne na analizatorze hematologicznym, co zwiększa wydajność pracy specjalistów. A nowoczesne urządzenia pozwalają to osiągnąć. Właśnie tego potrzebuje laboratorium: łatwość obsługi, wydajność i ograniczenie pracy mikroskopu.
Niepokojące jest to, że niektórzy lekarze z laboratoriów klinicznych koncentrują swoje wysiłki na ulepszaniu technologii, a nie na jej optymalizacji w celu podejmowania rozsądnych decyzji medycznych. Możesz kupić najdziwniejszy instrument laboratoryjny na świecie, ale jeśli stale sprawdzasz wyniki, to eliminuje to możliwości technologa. Nieprawidłowości nie są błędami, a laboratoria, które automatycznie weryfikują tylko wynik „Nie znaleziono nieprawidłowych komórek” z analizatora hematologicznego, działają nielogicznie.
Każde laboratorium powinno zdefiniować kryteria, według których testy powinny być przeglądane, a które powinny być przetwarzane ręcznie. W ten sposób zmniejsza się całkowita ilość pracy niezautomatyzowanej. Jest czas na pracę z nienormalnymleukogramy.
Oprogramowanie umożliwia laboratoriom ustalanie reguł automatycznej walidacji i identyfikacji podejrzanych próbek na podstawie lokalizacji próbki lub grupy badawczej. Na przykład, jeśli laboratorium przetwarza dużą liczbę próbek raka, system można skonfigurować tak, aby automatycznie analizował krew na analizatorze hematologicznym.
Ważne jest nie tylko automatyczne potwierdzanie normalnych wyników, ale także zmniejszenie liczby fałszywych alarmów. Analiza ręczna jest najtrudniejsza technicznie. Jest to najbardziej pracochłonny proces. Konieczne jest skrócenie czasu, jaki laborant spędza przy mikroskopie, ograniczając go tylko do przypadków nietypowych.
Producenci sprzętu oferują wysokowydajne systemy automatyzacji dla dużych laboratoriów, które pomagają radzić sobie z brakami kadrowymi. W takim przypadku asystent laboratorium umieszcza próbki w automatycznej linii. Następnie system wysyła probówki do analizatora i dalej do dalszych testów lub do „magazynu” z kontrolowaną temperaturą, gdzie można szybko pobrać próbki do dodatkowych testów. Zautomatyzowane nakładanie rozmazu i moduły barwienia również skracają czas personelu. Na przykład analizator hematologiczny Mindray CAL 8000 wykorzystuje moduł przetwarzania wymazów SC-120, który może obsłużyć 40 µl próbek z obciążeniem 180 preparatów. Wszystkie szklanki są podgrzewane przed i po barwieniu. Optymalizuje to jakość i zmniejsza ryzyko infekcji personelu.
Stopień automatyzacji wZwiększy się liczba laboratoriów hematologicznych, a zmniejszy się liczba personelu. Potrzebne są złożone systemy, w których można umieszczać próbki, zmieniać zadania i wracać tylko po to, aby przejrzeć naprawdę nietypowe próbki.
Większość systemów automatyzacji można dostosować do każdego laboratorium, a w niektórych przypadkach dostępne są standardowe konfiguracje. Niektóre laboratoria korzystają z własnego oprogramowania z własnym systemem informacyjnym i nietypowymi algorytmami pobierania próbek. Ale powinieneś unikać automatyzacji ze względu na automatyzację. Duże inwestycje w robotyczny projekt nowoczesnego, drogiego, zaawansowanego technologicznie automatycznego laboratorium są daremne z powodu elementarnego błędu polegającego na powtarzaniu badania krwi każdej próbki z nieprawidłowym wynikiem.
Zliczanie automatyczne
Większość automatycznych analizatorów hematologicznych mierzy lub oblicza następujące parametry: hemoglobinę, hematokryt, liczbę czerwonych krwinek i średnią objętość, średnią hemoglobinę, średnie stężenie hemoglobiny komórkowej, liczbę płytek krwi i średnią objętość oraz liczbę leukocytów.
Hemoglobina jest mierzona bezpośrednio z próbki krwi pełnej przy użyciu metody cyjanometru hemoglobiny.
Podczas badania analizatora hematologicznego można zliczać czerwone i białe krwinki oraz płytki krwi na kilka sposobów. Wiele mierników wykorzystuje metodę impedancji elektrycznej. Onopiera się na zmianie przewodnictwa, gdy komórki przechodzą przez małe otwory. Rozmiary tych ostatnich różnią się dla erytrocytów, leukocytów i płytek krwi. Zmiana przewodności skutkuje impulsem elektrycznym, który można wykryć i zarejestrować. Ta metoda pozwala również zmierzyć objętość komórki. Określenie wzoru leukocytów wymaga lizy erytrocytów. Różne populacje leukocytów są następnie identyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej.
Analizator hematologiczny Mindray VS-6800, na przykład, po ekspozycji próbek z odczynnikami, bada je w oparciu o dane dotyczące rozpraszania światła laserowego i fluorescencji. Aby lepiej identyfikować i różnicować populacje krwinek, zwłaszcza w celu wykrycia nieprawidłowości niewykrywanych innymi metodami, budowany jest diagram 3D. Analizator hematologiczny BC-6800 dostarcza dane o niedojrzałych granulocytach (w tym promielocytach, mielocytach i metamielocytach), populacjach komórek fluorescencyjnych (takich jak blasty i atypowe limfocyty), niedojrzałych retikulocytach i zakażonych erytrocytach, oprócz standardowych testów.
W analizatorze hematologicznym MEK-9100K firmy Nihon Kohden komórki krwi są idealnie wyrównane przez hydrodynamicznie zogniskowany przepływ przed przejściem przez precyzyjny port zliczania impedancji. Ponadto metoda ta całkowicie eliminuje ryzyko ponownego zliczania komórek, co znacznie poprawia dokładność badań.
Laserowa technologia optyczna Celltac G DynaScatter pozwala uzyskać formułę leukocytów w niemal naturalnym stanie. WAnalizator hematologiczny MEK-9100K wykorzystuje 3-kątowy detektor rozpraszania. Pod jednym kątem można określić liczbę leukocytów, pod innym można uzyskać informacje o strukturze komórki i złożoności cząstek nukleochromatyny, a z boku - dane dotyczące wewnętrznej ziarnistości i globularności. Informacje graficzne 3D są obliczane przez ekskluzywny algorytm Nihon Kohden.
Cytometria przepływowa
Przeprowadzane dla próbek krwi, wszelkich płynów biologicznych, rozproszonego aspiratu szpiku kostnego, zniszczonej tkanki. Cytometria przepływowa to metoda charakteryzująca komórki pod względem wielkości, kształtu, składu biochemicznego lub antygenowego.
Zasada tego badania jest następująca. Komórki poruszają się kolejno przez kuwetę, gdzie są wystawione na wiązkę intensywnego światła. Komórki krwi rozpraszają światło we wszystkich kierunkach. Rozpraszanie w przód wynikające z dyfrakcji koreluje z objętością komórek. Rozproszenie boczne (pod kątem prostym) jest wynikiem załamania i w przybliżeniu charakteryzuje jego wewnętrzną ziarnistość. Dane dotyczące rozproszenia w przód i w bok mogą identyfikować, na przykład, populacje neutrofili i limfocytów, które różnią się wielkością i ziarnistością.
Fluorescencja jest również używana do wykrywania różnych populacji w cytometrii przepływowej. Przeciwciała monoklonalne stosowane do identyfikacji antygenów cytoplazmatycznych i powierzchniowych komórek są najczęściej znakowane związkami fluorescencyjnymi. Na przykład fluoresceinalub R-fikoerytryna mają różne widma emisyjne, pozwalające na identyfikację uformowanych pierwiastków po kolorze blasku. Zawiesina komórkowa jest inkubowana z dwoma przeciwciałami monoklonalnymi, z których każde znakowane jest innym fluorochromem. Gdy komórki krwi ze związanymi przeciwciałami przechodzą przez kuwetę, laser 488 nm wzbudza związki fluorescencyjne, powodując ich świecenie na określonych długościach fal. System soczewek i filtrów wykrywa światło i przetwarza je na sygnał elektryczny, który może być analizowany przez komputer. Różne elementy krwi charakteryzują się różnym rozpraszaniem bocznym i do przodu oraz intensywnością emitowanego światła na określonych długościach fal. Dane składające się z tysięcy zdarzeń są gromadzone, analizowane i podsumowywane na histogramie. Cytometria przepływowa znajduje zastosowanie w diagnostyce białaczek i chłoniaków. Zastosowanie różnych markerów przeciwciał pozwala na precyzyjną identyfikację komórek.
Analizator hematologiczny Sysmex wykorzystuje laurylosiarczan sodu do testowania hemoglobiny. Jest to metoda bezcyjankowa o bardzo krótkim czasie reakcji. Hemoglobina jest oznaczana w oddzielnym kanale, co minimalizuje interferencję z wysokimi stężeniami leukocytów.
Odczynniki
Wybierając aparat do badania krwi, weź pod uwagę liczbę odczynników wymaganych przez analizator hematologiczny, a także wymagania dotyczące kosztów i bezpieczeństwa. Czy można je kupić od dowolnego dostawcy, czy tylko od producenta? Na przykład Erba ELite 3 mierzy 20 parametrów z zaledwie trzema przyjaznymi dla środowiska i darmowymiodczynniki cyjankowe. Modele Beckman Coulter DxH 800 i DxH 600 wykorzystują tylko 5 odczynników do wszystkich zastosowań, w tym do zliczania erytrocytów jądrzastych i retikulocytów. ABX Pentra 60 to analizator hematologiczny z 4 odczynnikami i 1 rozcieńczalnikiem.
Ważna jest również częstotliwość wymiany odczynników. Na przykład Siemens ADVIA 120 posiada zapas chemikaliów analitycznych i myjących na 1850 testów.
Zautomatyzowana optymalizacja analizatora
W opinii ekspertów zbyt wiele uwagi poświęca się doskonaleniu instrumentów laboratoryjnych, a za mało – optymalizacji wykorzystania technologii automatycznych i ręcznych. Częścią problemu jest to, że laboratoria hematologiczne są szkolone w zakresie patologii anatomicznej, a nie medycyny laboratoryjnej.
Wielu specjalistów pełni funkcje weryfikacji, a nie interpretacji. Laboratorium powinno pełnić 2 funkcje: być odpowiedzialnym za wyniki analizy i interpretować je. Następnym krokiem będzie praktyka medycyny opartej na dowodach. Jeśli po przeprowadzeniu 10 000 testów nie ma dowodów na to, że nie można ich automatycznie zweryfikować z dokładnie tymi samymi wynikami, to nie należy tego robić. Jednocześnie, jeśli 10 000 analiz dostarczyło nowych informacji medycznych, to należy je zrewidować w świetle nowej wiedzy. Jak dotąd praktyka oparta na dowodach jest na poziomie początkowym.
Szkolenie personelu
Kolejnym problemem jest pomoc laborantom nie tylko w studiowaniu instrukcji analizatora hematologicznego,ale także zrozumieć otrzymane za jego pomocą informacje. Większość specjalistów nie ma takiej wiedzy technologicznej. Ponadto zrozumienie graficznej reprezentacji danych jest ograniczone. Należy podkreślić jego korelację z ustaleniami morfologicznymi, aby można było uzyskać więcej informacji. Nawet pełna morfologia krwi staje się zbyt złożona, generując ogromną ilość danych. Wszystkie te informacje muszą być zintegrowane. Korzyści płynące z większej ilości danych należy zestawić z dodatkową złożonością, jaką one ze sobą niosą. Nie oznacza to, że laboratoria nie powinny akceptować zdobyczy zaawansowanych technologii. Niezbędne jest połączenie ich z doskonaleniem praktyki lekarskiej.
