Koncepcja immobilizowanych enzymów pojawiła się po raz pierwszy w drugiej połowie XX wieku. Tymczasem już w 1916 roku odkryto, że sacharoza zaadsorbowana na węglu zachowała swoją aktywność katalityczną. W 1953 r. D. Schleit i N. Grubhofer przeprowadzili pierwsze wiązanie pepsyny, amylazy, karboksypeptydazy i RNazy z nierozpuszczalnym nośnikiem. Koncepcja enzymów immobilizowanych została zalegalizowana w 1971 roku. Stało się to na pierwszej konferencji poświęconej enzymologii inżynierskiej. Obecnie pojęcie enzymów unieruchomionych jest rozważane w szerszym znaczeniu niż pod koniec XX wieku. Przyjrzyjmy się bliżej tej kategorii.
Informacje ogólne
Unieruchomione enzymy to związki sztucznie związane z nierozpuszczalnym nośnikiem. Zachowują jednak swoje właściwości katalityczne. Obecnie proces ten rozpatrywany jest w dwóch aspektach - w ramach częściowego i całkowitego ograniczenia swobody ruchu cząsteczek białka.
Godność
Naukowcy odkryli pewne zalety immobilizowanych enzymów. Działając jako katalizatory heterogeniczne, można je łatwo oddzielić od środowiska reakcji. W ramach prowadzonych badań stwierdzono, że stosowanie unieruchomionych enzymów można powtórzyć. Podczas procesu wiązania połączenia zmieniają swoje właściwości. Nabierają specyficzności i stabilności podłoża. Jednocześnie ich aktywność zaczyna być uzależniona od warunków środowiskowych. Unieruchomione enzymy są trwałe i mają wysoki stopień stabilności. Jest większa niż na przykład liczba wolnych enzymów o tysiące, dziesiątki tysięcy razy. Wszystko to zapewnia wysoką wydajność, konkurencyjność i ekonomiczność technologii, w których obecne są unieruchomione enzymy.
Media
J. Poratu zidentyfikował kluczowe właściwości idealnych materiałów do zastosowania w immobilizacji. Nosiciele muszą mieć:
- Nierozpuszczalność.
- Wysoka odporność biologiczna i chemiczna.
- Możliwość szybkiej aktywacji. Nośniki powinny łatwo stać się reaktywne.
- Znaczna hydrofilowość.
- Niezbędna przepuszczalność. Jego wskaźnik powinien być jednakowo akceptowalny zarówno dla enzymów, jak i koenzymów, produktów reakcji i substratów.
Obecnie nie ma materiału, który w pełni spełnia te wymagania. Niemniej jednak w praktyce stosuje się nośniki nadające się do unieruchomienia.określonej kategorii enzymów w określonych warunkach.
Klasyfikacja
W zależności od ich charakteru materiały, w związku z którymi związki przekształcane są w unieruchomione enzymy, dzielą się na nieorganiczne i organiczne. Wiązanie wielu związków odbywa się za pomocą nośników polimerowych. Te materiały organiczne dzielą się na 2 klasy: syntetyczną i naturalną. W każdym z nich z kolei wyróżnia się grupy w zależności od struktury. Nośniki nieorganiczne reprezentowane są głównie przez materiały wykonane ze szkła, ceramiki, gliny, żelu krzemionkowego i czerni grafitowej. Podczas pracy z materiałami popularne są metody chemii suchej. Unieruchomione enzymy uzyskuje się przez powlekanie nośników warstwą tlenków tytanu, glinu, cyrkonu, hafnu lub obróbkę polimerami organicznymi. Ważną zaletą materiałów jest łatwość regeneracji.
Nośniki białka
Najbardziej popularne są materiały lipidowe, polisacharydowe i białkowe. Wśród tych ostatnich warto wyróżnić polimery strukturalne. Należą do nich przede wszystkim kolagen, fibryna, keratyna i żelatyna. Takie białka są szeroko rozpowszechnione w środowisku naturalnym. Są niedrogie i ekonomiczne. Ponadto posiadają dużą liczbę grup funkcyjnych do wiązania. Białka są biodegradowalne. Pozwala to na rozszerzenie zastosowania unieruchomionych enzymów w medycynie. Tymczasem białka mają też negatywne właściwości. Wadami stosowania unieruchomionych enzymów na nośnikach białkowych jest wysoka immunogenność tych ostatnich, a także:możliwość wprowadzania w reakcje tylko określonych ich grup.
Polisacharydy, aminosacharydy
Spośród tych materiałów najczęściej używa się chityny, dekstranu, celulozy, agarozy i ich pochodnych. Aby polisacharydy były bardziej odporne na reakcje, ich łańcuchy liniowe są sieciowane epichlorohydryną. Do struktur sieci swobodnie wprowadzane są różne grupy jonogenne. Chityna gromadzi się w dużych ilościach jako odpad podczas przemysłowego przetwarzania krewetek i krabów. Substancja ta jest odporna chemicznie i ma dobrze zdefiniowaną strukturę porowatą.
Polimery syntetyczne
Ta grupa materiałów jest bardzo zróżnicowana i dostępna. Obejmuje polimery na bazie kwasu akrylowego, styrenu, polialkoholu winylowego, polimery poliuretanowe i poliamidowe. Większość z nich jest wytrzymała mechanicznie. W procesie transformacji dają możliwość różnicowania wielkości porów w dość szerokim zakresie, wprowadzając różne grupy funkcyjne.
Metody wiązania
Obecnie istnieją dwie zasadniczo różne opcje unieruchomienia. Pierwszym z nich jest otrzymanie związków bez wiązań kowalencyjnych z nośnikiem. Ta metoda jest fizyczna. Inna opcja polega na pojawieniu się wiązania kowalencyjnego z materiałem. To jest metoda chemiczna.
Adsorpcja
Za jego pomocą uzyskuje się unieruchomione enzymy poprzez trzymanie leku na powierzchni nośnika dziękioddziaływania dyspersyjne, hydrofobowe, elektrostatyczne i wiązania wodorowe. Adsorpcja była pierwszym sposobem ograniczenia ruchliwości pierwiastków. Jednak nawet teraz ta opcja nie straciła na aktualności. Ponadto adsorpcja jest uważana za najczęstszą metodę immobilizacji w branży.
Cechy metody
Publikacje naukowe opisują ponad 70 enzymów uzyskanych metodą adsorpcji. Nośnikami było głównie szkło porowate, różne glinki, polisacharydy, tlenki glinu, polimery syntetyczne, tytan i inne metale. Te ostatnie są najczęściej używane. O efektywności adsorpcji leku na nośniku decyduje porowatość materiału oraz powierzchnia właściwa.
Mechanizm działania
Adsorpcja enzymów na materiałach nierozpuszczalnych jest prosta. Uzyskuje się to poprzez kontakt wodnego roztworu leku z nośnikiem. Może przechodzić w sposób statyczny lub dynamiczny. Roztwór enzymu miesza się ze świeżym osadem, na przykład wodorotlenkiem tytanu. Związek następnie suszy się w łagodnych warunkach. Aktywność enzymatyczna podczas takiego unieruchomienia zostaje zachowana prawie w 100%. Jednocześnie specyficzne stężenie osiąga 64 mg na gram nośnika.
Negatywne chwile
Wady adsorpcji obejmują niską siłę wiązania enzymu i nośnika. W procesie zmiany warunków reakcji można zauważyć utratę pierwiastków, zanieczyszczenie produktów i desorpcję białek. Aby poprawić siłęnośniki wiążące są wstępnie modyfikowane. W szczególności materiały traktuje się jonami metali, polimerami, związkami hydrofobowymi i innymi środkami wielofunkcyjnymi. W niektórych przypadkach sam lek jest modyfikowany. Ale dość często prowadzi to do spadku jego aktywności.
Włączenie do żelu
Ta opcja jest dość powszechna ze względu na swoją wyjątkowość i prostotę. Ta metoda jest odpowiednia nie tylko dla poszczególnych elementów, ale także dla kompleksów wieloenzymatycznych. Włączenie do żelu można wykonać na dwa sposoby. W pierwszym przypadku lek łączy się z wodnym roztworem monomeru, po czym przeprowadza się polimeryzację. W efekcie pojawia się przestrzenna struktura żelowa, zawierająca w komórkach cząsteczki enzymów. W drugim przypadku lek wprowadza się do roztworu gotowego polimeru. Następnie przechodzi w stan żelu.
Intruzja w przezroczyste struktury
Istotą tej metody immobilizacji jest oddzielenie wodnego roztworu enzymu od substratu. W tym celu stosuje się półprzepuszczalną membranę. Umożliwia przenikanie elementów kofaktorów i substratów o niskiej masie cząsteczkowej i zatrzymuje duże cząsteczki enzymów.
Mikrokapsułkowanie
Istnieje kilka opcji osadzania w przezroczystych strukturach. Spośród nich największym zainteresowaniem cieszy się mikroenkapsulacja i włączanie białek do liposomów. Pierwszą opcję zaproponował w 1964 roku T. Chang. Polega na tym, że roztwór enzymu wprowadza się do zamkniętej kapsułki, której ścianki wykonane są z półprzepuszczalnejpolimer. Pojawienie się membrany na powierzchni spowodowane jest reakcją międzyfazowej polikondensacji związków. Jeden z nich rozpuszcza się w fazie organicznej, a drugi - w fazie wodnej. Przykładem jest tworzenie mikrokapsułki otrzymanej przez polikondensację halogenku kwasu sebacynowego (faza organiczna) i heksametylenodiaminy-1,6 (odpowiednio faza wodna). Grubość membrany oblicza się w setnych częściach mikrometra. Rozmiar kapsułek to setki lub dziesiątki mikrometrów.
Włączenie do liposomów
Ta metoda immobilizacji jest bliska mikroenkapsulacji. Liposomy prezentowane są w lamelarnych lub kulistych układach dwuwarstw lipidowych. Ta metoda została po raz pierwszy zastosowana w 1970 roku. Aby wyizolować liposomy z roztworu lipidów, rozpuszczalnik organiczny jest odparowywany. Pozostała cienka warstwa jest zdyspergowana w roztworze wodnym, w którym obecny jest enzym. Podczas tego procesu następuje samoorganizacja dwuwarstwowych struktur lipidowych. Takie unieruchomione enzymy są dość popularne w medycynie. Wynika to z faktu, że większość cząsteczek jest zlokalizowana w macierzy lipidowej błon biologicznych. Immobilizowane enzymy zawarte w liposomach są najważniejszym materiałem badawczym w medycynie, który umożliwia badanie i opisywanie wzorców procesów życiowych.
Utworzenie nowych obligacji
Immobilizacja poprzez tworzenie nowych łańcuchów kowalencyjnych między enzymami i nośnikami jest uważana za najbardziej rozpowszechnioną metodę otrzymywania przemysłowych biokatalizatorów.miejsce docelowe. W przeciwieństwie do metod fizycznych, ta opcja zapewnia nieodwracalne i silne wiązanie między cząsteczką a materiałem. Jego powstawaniu często towarzyszy stabilizacja leku. Jednocześnie usytuowanie enzymu w odległości pierwszego wiązania kowalencyjnego względem nośnika stwarza pewne trudności w realizacji procesu katalitycznego. Cząsteczka jest oddzielona od materiału za pomocą wkładki. Jest często stosowany jako środek wielofunkcyjny i dwufunkcyjny. W szczególności są to hydrazyna, bromocyjan, dialhedryd glutarowy, chlorek sulfurylu itp. Na przykład, aby usunąć galaktozylotransferazę, między nośnik i enzym wstawia się następującą sekwencję -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. W takiej sytuacji w strukturze występuje wstawka, cząsteczka i nośnik. Wszystkie są połączone wiązaniami kowalencyjnymi. Fundamentalne znaczenie ma konieczność wprowadzenia do reakcji grup funkcyjnych, które nie są istotne dla katalitycznej funkcji pierwiastka. Tak więc z reguły glikoproteiny są przyłączane do nośnika nie przez białko, ale przez część węglowodanową. W rezultacie uzyskuje się bardziej stabilne i aktywne unieruchomione enzymy.
Komórki
Opisane powyżej metody są uważane za uniwersalne dla wszystkich typów biokatalizatorów. Należą do nich między innymi komórki, struktury subkomórkowe, których unieruchomienie w ostatnim czasie stało się powszechne. Wynika to z następujących powodów. Gdy komórki są unieruchomione, nie ma potrzeby izolowania i oczyszczania preparatów enzymatycznych ani wprowadzania do reakcji kofaktorów. W rezultacie możliwe staje się:systemy realizujące wieloetapowe procesy ciągłe.
Zastosowanie unieruchomionych enzymów
W weterynarii, przemyśle i innych sektorach gospodarki leki otrzymywane powyższymi metodami są dość popularne. Opracowane w praktyce podejścia rozwiązują problemy celowanego dostarczania leków do organizmu. Unieruchomione enzymy umożliwiły uzyskanie leków o przedłużonym działaniu przy minimalnej alergenności i toksyczności. Obecnie naukowcy rozwiązują problemy związane z biokonwersją masy i energii za pomocą podejść mikrobiologicznych. Tymczasem technologia immobilizowanych enzymów również wnosi istotny wkład w pracę. Perspektywy rozwoju wydają się dość szerokie. Tak więc w przyszłości jedną z kluczowych ról w procesie monitorowania stanu środowiska powinny należeć nowe rodzaje analiz. W szczególności mówimy o metodach bioluminescencyjnych i immunoenzymatycznych. Zaawansowane podejścia mają szczególne znaczenie w przetwórstwie surowców lignocelulozowych. Unieruchomione enzymy mogą być stosowane jako wzmacniacze słabych sygnałów. Centrum aktywne może znajdować się pod wpływem nośnika, który jest poddawany działaniu ultradźwięków, naprężeniom mechanicznym lub podlega przemianom fitochemicznym.
