Wszystkie reakcje biochemiczne zachodzące w organizmie podlegają specyficznej kontroli, która jest realizowana poprzez działanie aktywujące lub hamujące na enzymy regulatorowe. Te ostatnie zwykle znajdują się na początku łańcuchów przemian metabolicznych i albo uruchamiają wieloetapowy proces, albo go spowalniają. Niektóre pojedyncze reakcje również podlegają regulacji. Inhibicja konkurencyjna jest jednym z głównych mechanizmów kontroli katalitycznej aktywności enzymów.
Co to jest hamowanie?
Mechanizm katalizy enzymatycznej opiera się na wiązaniu aktywnego miejsca enzymu z cząsteczką substratu (kompleks ES), co powoduje reakcję chemiczną z utworzeniem i uwolnieniem produktu (E+S=ES=EP=E+P).
Hamowanie enzymu to zmniejszenie szybkości lub całkowite zatrzymanie procesu katalizy. W węższymsens, termin ten oznacza zmniejszenie powinowactwa centrum aktywnego do substratu, co osiąga się poprzez wiązanie cząsteczek enzymu z substancjami inhibitorowymi. Te ostatnie mogą działać na różne sposoby, na podstawie których dzieli się je na kilka typów, które odpowiadają mechanizmom hamowania o tej samej nazwie.
Główne rodzaje zahamowań
Ze względu na naturę procesu, hamowanie może być dwojakiego rodzaju:
- Nieodwracalne - powoduje trwałe zmiany w cząsteczce enzymu, pozbawiając ją aktywności funkcjonalnej (ta ostatnia nie może zostać przywrócona). Może być specyficzny lub niespecyficzny. Inhibitor silnie wiąże się z enzymem poprzez oddziaływanie kowalencyjne.
- Odwracalny - główny rodzaj negatywnej regulacji enzymów. Odbywa się to dzięki odwracalnemu specyficznemu przyłączeniu inhibitora do białka enzymu za pomocą słabych wiązań niekowalencyjnych, podlegających opisowi kinetycznemu według równania Michaelisa-Mentena (z wyjątkiem regulacji allosterycznej).
Istnieją dwa główne typy odwracalnej inhibicji enzymów: konkurencyjne (może być osłabione przez zwiększenie stężenia substratu) i niekompetycyjne. W tym drugim przypadku maksymalna możliwa szybkość katalizy spada.
Główna różnica między hamowaniem kompetycyjnym i niekonkurencyjnym polega na miejscu przyłączenia substancji regulatorowej do enzymu. W pierwszym przypadku inhibitor wiąże się bezpośrednio z miejscem aktywnym, a w drugim z innym miejscem enzymu lub z kompleksem enzym-substrat.
Istnieje również mieszany rodzaj hamowania, w którym wiązanie z inhibitorem nie zapobiega powstawaniu ES, ale spowalnia katalizę. W tym przypadku substancja regulatorowa wchodzi w skład kompleksów podwójnych lub potrójnych (EI i EIS). W typie niekonkurencyjnym enzym wiąże się tylko z ES.
Cechy odwracalnego konkurencyjnego hamowania enzymów
Konkurencyjny mechanizm hamowania opiera się na podobieństwie strukturalnym substancji regulatorowej do substratu. W rezultacie powstaje kompleks centrum aktywnego z inhibitorem, umownie określany jako EI.
Odwracalne hamowanie konkurencyjne ma następujące cechy:
- wiązanie z inhibitorem następuje w miejscu aktywnym;
- inaktywacja cząsteczki enzymu jest odwracalna;
- działanie hamujące można zmniejszyć, zwiększając stężenie substratu;
- inhibitor nie wpływa na maksymalną szybkość katalizy enzymatycznej;
- kompleks EI może się rozkładać, co charakteryzuje się odpowiednią stałą dysocjacji.
Przy tego rodzaju regulacji inhibitor i substrat wydają się konkurować (konkurować) ze sobą o miejsce w centrum aktywnym, stąd nazwa procesu.
W rezultacie hamowanie kompetycyjne można zdefiniować jako odwracalny proces hamowania katalizy enzymatycznej, w oparciu o specyficzne powinowactwo miejsca aktywnego do substancji hamującej.
Mechanizm działania
Tetheringinhibitor z miejscem aktywnym zapobiega tworzeniu się kompleksu enzym-substrat niezbędnego do katalizy. W rezultacie cząsteczka enzymu staje się nieaktywna. Niemniej jednak centrum katalityczne może wiązać się nie tylko z inhibitorem, ale także z podłożem. Prawdopodobieństwo powstania takiego lub innego kompleksu zależy od stosunku stężeń. Jeśli jest znacznie więcej cząsteczek substratu, enzym będzie reagował z nimi częściej niż z inhibitorem.
Wpływ na szybkość reakcji chemicznej
Stopień hamowania katalizy podczas hamowania kompetycyjnego zależy od tego, ile enzymu utworzy kompleksy EI. W takim przypadku możliwe jest zwiększenie stężenia substratu do takiego stopnia, że rola inhibitora zostanie zastąpiona, a szybkość katalizy osiągnie maksymalną możliwą wartość odpowiadającą wartości Vmaxzgodnie z równaniem Michaelisa-Mentena.
Zjawisko to jest spowodowane silnym rozcieńczeniem inhibitora. W efekcie prawdopodobieństwo związania się z nim cząsteczek enzymu spada do zera, a centra aktywne reagują tylko z substratem.
Zależności kinetyczne reakcji enzymatycznej z udziałem konkurencyjnego inhibitora
Inhibicja kompetycyjna zwiększa stałą Michaelisa (Km), która jest równa stężeniu substratu wymaganemu do osiągnięcia ½ maksymalnej szybkości katalizy na początku reakcji. Ilość enzymu hipotetycznie zdolnego do wiązania się z substratem pozostaje stała, natomiast liczba ES-kompleksy zależą tylko od stężenia tego ostatniego (kompleksy EI nie są stałe i mogą być wypierane przez substrat).
Konkurencyjne hamowanie enzymów można łatwo określić na podstawie wykresów zależności kinetycznej zbudowanej dla różnych stężeń substratu. W tym przypadku wartość Km zmieni się, podczas gdy Vmax pozostanie stała.
W przypadku hamowania niekonkurencyjnego jest odwrotnie: inhibitor wiąże się poza centrum aktywnym i obecność substratu nie może na to w żaden sposób wpływać. W rezultacie niektóre cząsteczki enzymu są „wyłączane” z katalizy, a maksymalna możliwa szybkość spada. Niemniej jednak aktywne cząsteczki enzymu mogą łatwo wiązać się z substratem zarówno przy niskich, jak i przy wysokich stężeniach tego ostatniego. Dlatego stała Michaelisa pozostaje stała.
Wykresy konkurencyjnego hamowania w układzie podwójnie odwrotnych współrzędnych to kilka prostych przecinających oś y w punkcie 1/Vmax. Każda linia prosta odpowiada pewnemu stężeniu podłoża. Różne punkty przecięcia z osią odciętych (1/[S]) wskazują na zmianę stałej Michaelisa.
Działanie konkurencyjnego inhibitora na przykładzie malonianu
Typowym przykładem hamowania kompetycyjnego jest proces zmniejszania aktywności dehydrogenazy bursztynianowej, enzymu katalizującego utlenianie kwasu bursztynowego (bursztynianu) do kwasu fumarowego. Tutaj jako inhibitormalonian działa, mając strukturalne podobieństwo do bursztynianu.
Dodanie inhibitora do pożywki powoduje tworzenie się kompleksów malonianu z dehydrogenazą bursztynianową. Takie wiązanie nie powoduje uszkodzenia miejsca aktywnego, ale blokuje jego dostęp do kwasu bursztynowego. Zwiększenie stężenia bursztynianu zmniejsza działanie hamujące.
Zastosowanie medyczne
Działanie wielu leków, które są strukturalnymi analogami substratów niektórych szlaków metabolicznych, których hamowanie jest niezbędnym elementem leczenia chorób, opiera się na mechanizmie hamowania kompetycyjnego.
Na przykład, aby poprawić przewodzenie impulsów nerwowych w dystrofiach mięśniowych, konieczne jest zwiększenie poziomu acetylocholiny. Osiąga się to poprzez hamowanie aktywności hydrolizującej acetylocholinoesterazy. Inhibitory to czwartorzędowe zasady amoniowe, które są częścią leków (prożywica, endrofon, itp.).
Antymetabolity dzielą się na specjalną grupę, które oprócz działania hamującego wykazują właściwości pseudosubstratu. W tym przypadku tworzenie kompleksu EI prowadzi do powstania biologicznie obojętnego produktu anomalnego. Antymetabolity obejmują sulfonamidy (stosowane w leczeniu infekcji bakteryjnych), analogi nukleotydów (stosowane do zatrzymania wzrostu komórek guza nowotworowego) itp.
