Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) to metoda biologii molekularnej, która pozwala na wykrycie niewielkich ilości kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) w materiale biologicznym, a dokładniej niektórych jego fragmentów i pomnożenie ich wielokrotnie. Następnie identyfikuje się je wizualnie za pomocą elektroforezy żelowej. Reakcja została opracowana w 1983 roku przez K. Mullisa i znajduje się na liście wybitnych odkryć ostatnich lat.
Jakie są mechanizmy PCR
Cała technika opiera się na zdolności kwasów nukleinowych do samoreplikacji, która w tym przypadku jest przeprowadzana sztucznie w laboratorium. Reprodukcja DNA nie może rozpocząć się w żadnym regionie cząsteczki, a jedynie w regionach o określonej sekwencji nukleotydowej – fragmentach początkowych. Aby rozpoczęła się reakcja łańcuchowa polimerazy, potrzebne są startery (lub sondy DNA). Są to krótkie fragmenty łańcucha DNA o określonej sekwencji nukleotydowej. Są one komplementarne (tj. odpowiadają) do początkowych regionów DNA próbki.
Oczywiście, aby stworzyć startery, naukowcy muszą zbadać sekwencję nukleotydową kwasu nukleinowego zaangażowanego w technikę. To właśnie te sondy DNA zapewniają specyficzność reakcji i jej inicjację. Reakcja łańcuchowa polimerazy nie zajdzie, jeśli w próbce nie zostanie znaleziona co najmniej jedna cząsteczka pożądanego DNA. Ogólnie rzecz biorąc, powyższe startery, zestaw nukleotydów, odporna na ciepło polimeraza DNA są niezbędne do zajścia reakcji. Ten ostatni to enzym – katalizator syntezy nowych cząsteczek kwasu nukleinowego na podstawie próbki. Wszystkie te substancje, w tym materiał biologiczny, w którym konieczne jest wykrycie DNA, łączy się w mieszaninę reakcyjną (roztwór). Umieszczony jest w specjalnym termostacie, który wykonuje bardzo szybkie nagrzewanie i schładzanie przez zadany czas - cykl. Zwykle jest 30-50.
Jak działa ta reakcja
Jego istota polega na tym, że podczas jednego cyklu startery są przyłączane do pożądanych odcinków DNA, po czym zostaje on podwojony pod wpływem działania enzymu. W oparciu o powstałe nici DNA, w kolejnych cyklach syntetyzowane są nowe i nowe identyczne fragmenty cząsteczki.
Reakcja łańcuchowa polimerazy przebiega sekwencyjnie, rozróżnia się jej kolejne etapy. Pierwszy charakteryzuje się podwojeniem ilości produktu podczas każdego cyklu ogrzewania i chłodzenia. W drugim etapie reakcja ulega spowolnieniu, ponieważ enzym ulega uszkodzeniu, a także traci aktywność. Ponadto wyczerpane są rezerwy nukleotydów i starterów. Na ostatnim etapie - plateau - produkty już się nie kumulują,ponieważ odczynniki się skończyły.
Gdzie jest używany
Niewątpliwie reakcja łańcuchowa polimerazy znajduje najszersze zastosowanie w medycynie i nauce. Znajduje zastosowanie w biologii ogólnej i prywatnej, weterynarii, farmacji, a nawet ekologii. Co więcej, w tych ostatnich robią to w celu monitorowania jakości produktów spożywczych i obiektów środowiskowych. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest aktywnie wykorzystywana w praktyce sądowej w celu potwierdzenia ojcostwa i identyfikacji osoby. W kryminalistyce, a także w paleontologii, ta technika jest często jedynym wyjściem, ponieważ zwykle bardzo mało DNA jest dostępne do badań. Oczywiście metoda znalazła bardzo szerokie zastosowanie w medycynie praktycznej. Jest potrzebna w takich dziedzinach jak genetyka, choroby zakaźne i choroby onkologiczne.
