Metoda hodowli tkankowych jest jednym z głównych narzędzi współczesnej biotechnologii, pozwalającym rozwiązywać praktyczne problemy fizjologii, biochemii i genetyki roślin. Sztuczna uprawa materiału odbywa się pod pewnymi warunkami: sterylizacja, kontrola temperatury i ekspozycja na specjalną pożywkę.
Esencja
Metodą hodowli tkankowych jest ich długotrwała konserwacja i/lub sztuczna hodowla w warunkach laboratoryjnych na pożywce. Technologia ta pozwala na stworzenie modelu biologicznego do badania różnych procesów w komórkach, które istnieją poza organizmem roślin, ludzi i zwierząt.
Rozmnażanie kultur tkankowych roślin opiera się na właściwości totipotencji - zdolności komórek do przekształcenia się w cały organizm. U zwierząt jest to realizowane tylko w zapłodnionych jajach (z wyjątkiem niektórych typów koelenteratów).
Historia rozwoju
Pierwsze próby hodowli tkanek roślinnych podjęli niemieccy naukowcy na przełomie XIX i XX wieku. Pomimo tego, że się nie powiodły, sformułowano szereg pomysłów, które później potwierdziły się.
W 1922 W. Robbins i W. Kotte, niezależnie od siebie, byli w stanie wyhodować czubki korzeni kukurydzy i pomidora na sztucznej pożywce. Szczegółowe badania technik hodowli komórek i tkanek rozpoczęto w latach 30. XX wieku. XX wiek R. Gautre i F. White udowodnili, że przy okresowym przeszczepianiu kultur tkankowych do świeżej pożywki mogą one rosnąć w nieskończoność.
Do 1959 r. w warunkach laboratoryjnych uprawiano 142 gatunki roślin. W drugiej połowie XX wieku. rozpoczęto również stosowanie rozproszonych (odseparowanych) komórek.
Rodzaje materiałów testowych
Istnieją 2 główne typy kultur tkanek roślinnych:
- Wyprodukowane bez zniszczenia i z zachowaniem charakterystycznych cech tkwiących w żywym organizmie.
- Ekstrahowany przez degradację (chemiczną, enzymatyczną lub mechaniczną) z tkanki pierwotnej. Może być utworzony z jednej lub więcej kultur komórkowych.
Następujące metody wyróżniają się metodą uprawy:
- na „warstwie żywieniowej”, w której substancja stymulująca wzrost tkanek jest wydzielana przez dzielące się komórki tego samego gatunku roślin;
- używając tkanki pielęgniarskiej obok hodowanych komórek;
- użycie pożywki z wyizolowanej dzielącej się grupy komórek;
- hodowlane pojedyncze pojedyncze komórki w mikrokropelce nasyconej składem.
Uprawa z pojedynczych komórek jest obarczona pewnymi trudnościami. Aby sztucznie „zmusić” je do podziału, muszą otrzymać sygnał od sąsiednich, aktywnie funkcjonujących komórek.
Jednym z głównych rodzajów tkanek do badań fizjologicznych jest kalus, który powstaje pod wpływem niekorzystnych czynników zewnętrznych (zwykle urazów mechanicznych). Mają zdolność do utraty specyficznych cech właściwych oryginalnej tkance. W rezultacie komórki kalusa zaczynają się aktywnie dzielić i tworzą się części rośliny.
Niezbędne warunki
Sukces metody hodowli tkanek i komórek zależy od następujących czynników:
- Zgodność ze sterylnością. Do przeszczepu stosuje się specjalne pudełka z dostarczanym oczyszczonym powietrzem, wyposażone w lampy ultrafioletowe. Narzędzia i materiały, ubrania i ręce personelu powinny być poddawane obróbce aseptycznej.
- Stosowanie specjalnie dobranych pożywek zawierających źródła węgla i energii (zwykle sacharoza i glukoza), mikro- i makroelementy, regulatory wzrostu (auksyny, cytokininy), witaminy (tiamina, ryboflawina, kwas askorbinowy i pantotenowy i inne).
- Zgodność z temperaturą (18-30°C), warunkami oświetleniowymi i wilgotnością (60-70%). Większość kultur tkankowych kalusa hoduje się w świetle otoczenia, ponieważ nie zawierają chloroplastów, ale niektóre rośliny wymagają podświetlenia.
Obecnie gotoweskłady komercyjne (Murasige i Skoog, Gamborg i Eveleg, White, Kao i Mikhailyuk i inni).
Wady i zalety
Zaletami metody hodowli komórek i tkanek są:
- dobra powtarzalność uzyskanych wyników;
- regulacja interakcji międzykomórkowych;
- niskie zużycie odczynników;
- homogeniczność genetyczna linii komórkowych;
- możliwość mechanizacji procesu uprawy;
- kontrola warunków w klatce;
- przechowywanie żywych kultur w niskiej temperaturze.
Wadą tej biotechnologii jest:
- trzeba przestrzegać surowych warunków aseptyki;
- niestabilność właściwości komórek i możliwość ich niepożądanego mieszania;
- wysokie koszty chemikaliów;
- niepełna równoważność hodowanych tkanek i komórek w żywym organizmie.
Aplikacja
Metoda hodowli tkankowej użyta do badań:
- procesy wewnątrz komórek (synteza DNA, RNA i białek, metabolizm i wpływ na nie za pomocą leków);
- reakcje międzykomórkowe (przechodzenie substancji przez błony komórkowe, praca kompleksu hormon-receptor, zdolność komórek do wzajemnego przylegania, tworzenie struktur histologicznych);
- interakcje ze środowiskiem (absorpcja składników odżywczych, przenoszenie infekcji, procesy powstawania i rozwoju)nowotwory i inne);
- wyniki manipulacji genetycznych na komórkach.
Obiecujące obszary biologii i farmakologii, w rozwoju których ta technologia jest wykorzystywana, to:
- otrzymywanie skutecznych herbicydów, regulatorów wzrostu do upraw rolniczych, związków biologicznie czynnych do stosowania w produkcji leków (alkaloidy, sterydy i inne);
- mutageneza ukierunkowana, hodowla nowych mieszańców, przezwyciężanie niekompatybilności postgamicznej;
- rozmnażanie klonalne, które pozwala uzyskać dużą liczbę identycznych genetycznie roślin;
- hodowla roślin odpornych na wirusy i wolnych od wirusów;
- kriokonserwacja puli genów;
- rekonstrukcja tkanek, tworzenie źródeł komórek macierzystych (inżynieria tkankowa).
