Metody badań biologii molekularnej odgrywają dużą rolę we współczesnej medycynie, kryminalistyce i biologii. Dzięki postępom w badaniach DNA i RNA osoba jest w stanie zbadać genom organizmu, określić czynnik sprawczy choroby, rozpoznać pożądany kwas nukleinowy w mieszaninie kwasów itp.
Metody badań biologii molekularnej. Co to jest?
W latach 70. i 80. naukowcom po raz pierwszy udało się rozszyfrować ludzki genom. Wydarzenie to dało impuls do rozwoju inżynierii genetycznej i biologii molekularnej. Badanie właściwości DNA i RNA doprowadziło do tego, że obecnie możliwe jest wykorzystanie tych kwasów nukleinowych do diagnozowania choroby, badania genów.
Uzyskiwanie DNA i RNA
Molekularne metody diagnostyki biologicznej wymagają obecności materiału wyjściowego: częściej są to kwasy nukleinowe. Istnieje kilka sposobów na wyizolowanie tych substancji z komórek żywych organizmów. Każda z nich ma swoje wady i zalety i jest to konieczneweź pod uwagę przy wyborze metody izolacji czystych kwasów nukleinowych.
1. Pozyskiwanie DNA według Marmur. Metoda polega na potraktowaniu mieszaniny substancji alkoholem, w wyniku czego wytrąca się czysty DNA. Wadą tej metody jest stosowanie agresywnych substancji: fenolu i chloroformu.
2. Izolacja DNA według Booma. Główną stosowaną substancją jest tu tiocyjanian guanidyny (GuSCN). Przyczynia się do wytrącania kwasu dezoksyrybonukleinowego na wyspecjalizowanych podłożach, z których może być następnie zbierany za pomocą specjalnego buforu. GuSCN jest jednak inhibitorem PTC i nawet niewielka jego część, która dostanie się do wytrąconego DNA, może wpływać na przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy, która odgrywa ważną rolę w pracy z kwasami nukleinowymi.
3. Sedymentacja zanieczyszczeń. Metoda różni się od poprzednich tym, że wytrącane są nie cząsteczki kwasu dezoksyrybonukleinowego, ale zanieczyszczenia. W tym celu stosuje się wymieniacze jonowe. Wadą jest to, że nie wszystkie substancje mogą się wytrącać.
4. Pokaz masowy. Metoda ta jest stosowana w przypadkach, gdy nie są potrzebne dokładne informacje o składzie cząsteczki DNA, ale konieczne jest uzyskanie pewnych danych statystycznych. Wyjaśnia to fakt, że struktura kwasu nukleinowego może zostać uszkodzona pod wpływem detergentów, w szczególności zasad.
Klasyfikacja metod badawczych
Wszystkie metody badań biologii molekularnej są podzielone na trzy duże grupy:
1. Amplifikacja (przy użyciu wielu enzymów). Tutajodnosi się do PCR - reakcji łańcuchowej polimerazy, która odgrywa dużą rolę w wielu metodach diagnostycznych.
2. Brak wzmocnienia. Ta grupa metod jest bezpośrednio związana z działaniem mieszanin kwasów nukleinowych. Przykładami są 3 bloty, hybrydyzacja in situ itp.
3. Metody oparte na rozpoznawaniu sygnału z cząsteczki sondy, która wiąże się z określoną sondą DNA lub RNA. Przykładem jest Hybride Capture System (hc2).
Enzymy, które można wykorzystać w metodach badawczych biologii molekularnej
Wiele metod diagnostyki molekularnej wymaga użycia szerokiej gamy enzymów. Poniżej znajdują się najczęściej używane:
1. Enzym restrykcyjny – „tnie” cząsteczkę DNA na niezbędne części.
2. Polimeraza DNA - syntetyzuje dwuniciową cząsteczkę kwasu dezoksyrybonukleinowego.
3. Odwrotna transkryptaza (rewertaza) - stosowana do syntezy DNA na szablonie RNA.
4. Ligaza DNA - odpowiedzialna za tworzenie wiązań fosfodiestrowych między nukleotydami.
5. Egzonukleaza - usuwa nukleotydy z końcowych odcinków cząsteczki kwasu dezoksyrybonukleinowego.
PCR to główna metoda amplifikacji DNA
Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) jest aktywnie wykorzystywana we współczesnej biologii molekularnej. Jest to metoda, w której można uzyskać ogromną liczbę kopii z pojedynczej cząsteczki DNA (cząsteczki ulegają amplifikacji).
Główne funkcje PCR:
- diagnostykachoroby;
- klonowanie segmentów DNA, genów.
Do przeprowadzenia reakcji łańcuchowej polimerazy wymagane są następujące elementy: początkowa cząsteczka DNA, termostabilna polimeraza DNA (Taq lub Pfu), fosforany dezoksyrybonukleotydów (źródła zasad azotowych), startery (2 startery na 1 cząsteczkę DNA) oraz sam system buforowy, w którym możliwe są wszystkie reakcje.
PCR składa się z trzech etapów: denaturacji, wyżarzania podkładu i wydłużania.
1. Denaturacja. W temperaturze 94-95 stopni Celsjusza wiązania wodorowe między dwoma nićmi DNA ulegają zerwaniu, w wyniku czego otrzymujemy dwie jednoniciowe cząsteczki.
2. Wyżarzanie podkładu. W temperaturze 50-60 stopni Celsjusza startery są przyłączane do końców jednoniciowych cząsteczek kwasu nukleinowego według typu komplementarności.
3. Wydłużenie. W temperaturze 72 stopni zachodzi synteza potomnych dwuniciowych cząsteczek kwasu dezoksyrybonukleinowego.
Sekwencjonowanie DNA
Metody badań biologii molekularnej często wymagają znajomości sekwencji nukleotydów w cząsteczce kwasu dezoksyrybonukleinowego. Sekwencjonowanie przeprowadza się w celu określenia kodu genetycznego. Diagnostyka molekularna przyszłości będzie oparta na wiedzy uzyskanej z ludzkiego sekwencjonowania.
Wyróżnia się następujące rodzaje sekwencjonowania:
- Sekwencjonowanie Maxama-Gilberta;
- Sekwencjonowanie Sangera;
- pyrosekwencjonowanie;
- nanoporesekwencjonowanie.
