Hodowla bakterii: metody, zasady, etapy i warunki

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Ostatnio zmodyfikowany: 2023-12-17 05:38

Mikroorganizmy w otaczającej nas przyrodzie są wszędzie: w glebach, zbiornikach wodnych, na powierzchniach różnych przedmiotów zamieszkują przez nie ludzie i zwierzęta. Wszystko to może służyć jako źródło skażenia mikrobiologicznego żywności, leków i linii produkcyjnych. Hodowla bakterii jest niezbędna do badania ich właściwości, potrzeb i cech. To z kolei jest ważnym krokiem w rozwoju różnych leków, laboratoryjnej diagnostyce chorób, obliczaniu reaktorów produkcyjnych i wielu innych.

Pojęcia ogólne

Hodowla bakterii w mikrobiologii odnosi się do hodowli mikroorganizmów prowadzonej w laboratorium. Z kolei drobnoustroje, które wyrosły na wybranej pożywce, nazywamy kulturą. Kultury można mieszać, jeśli tworzą je różne rodzaje mikroorganizmów, a czyste, jeśli są reprezentowane przez tylko jeden rodzaj bakterii.

Jeśli odżywczeW pożywce umieszcza się tylko jedną komórkę, a w wyniku jej rozmnażania uzyskuje się grupę osobników, wtedy ten zestaw mikroorganizmów nazywamy klonem. Kiedy klon rozwija się do punktu, w którym staje się widoczny gołym okiem, ten zbiór bakterii nazywa się kolonią.

Zazwyczaj hodowlę bakterii izolowanych z różnych źródeł przeprowadza się oddzielnie od siebie. Każda taka oddzielnie hodowana grupa drobnoustrojów nazywana jest szczepem. Tak więc, jeśli jeden rodzaj gronkowca jest izolowany z trzech źródeł (lub różnych porcji tego samego produktu, różnych ludzi), mówi się o trzech szczepach tego typu gronkowca.

Czynniki wzrostu bakterii

Należą do nich różne aminokwasy, lipidy, zasady purynowe i inne związki niezbędne do rozwoju mikroorganizmów. Niektóre drobnoustroje mogą samodzielnie wytwarzać potrzebne im substancje, podczas gdy inne muszą otrzymywać je w postaci gotowej. W zależności od potrzeb drobnoustrojów w określonych czynnikach wzrostu przeprowadzana jest identyfikacja i różnicowanie bakterii. Również ten parametr jest ważny dla prawidłowego przygotowania pożywki do prac laboratoryjnych i biotechnologicznych:

• Aminokwasy. Bakterie mogą wymagać jednego konkretnego aminokwasu lub grupy kwasów. Tak więc Clostridia potrzebują leucyny i tyrozyny, paciorkowce potrzebują leucyny i argininy. Mikroorganizmy, które do wzrostu potrzebują aminokwasów z zewnątrz, nazywane są auksotrofami.
• Zasady purynowe i pirymidynowe oraz ich pochodne (adenina, guanina i inne). Są ważnym czynnikiem wzrostu wieluGatunek Streptococcus.
• Witaminy. Są częścią koenzymów wymaganych przez bakterie. Tak więc kwas nikotynowy, a także jego amid, który jest częścią NAD i NADP, jest potrzebny błonicy i Shigella corynebacteria. Tiamina, jako integralna część pirofosforanu, jest wymagana przez Staphylococcus aureus, pneumokoki, brucella. Kwas pantotenowy, który jest częścią koenzymu CoA, jest wymagany przez pałeczki tężca i niektóre rodzaje paciorkowców. Cytochromy, a zatem kwas foliowy, hemy i biotyna, które je tworzą, są niezbędne dla Mycobacterium tuberculosis i Haemophilus influenzae.

Wymagania dotyczące środowiska

Warunki dla pożywek do hodowli bakterii:

1. Odżywianie. Muszą ponadto zawierać substancje w łatwo przyswajalnej formie, niezbędne do odżywiania się i uzupełniania energii przez mikroorganizmy. Należą do nich organogeny i minerały. Niektóre mikroorganizmy wymagają dodatkowo witamin i aminokwasów, których nie są w stanie syntetyzować.
2. Optymalny poziom pH. Wpływa na przepuszczalność błony komórkowej, a tym samym na zdolność do wchłaniania składników odżywczych przez bakterię. Najczęściej wartość pH powinna być na poziomie 7, 2–7, 4. Wiele drobnoustrojów w ciągu swojego życia wytwarza produkty o odczynie kwaśnym lub zasadowym, a żeby pH pożywki się nie zmieniało, musi być buforowany.
3. Izotoniczny. Ciśnienie osmotyczne w pożywce do hodowli bakterii powinno mieć takie same wartości jakwewnątrz komórek drobnoustrojów. Zwykle odpowiada 0,5% roztworu NaCl.
4. Sterylność. Wynika to z faktu, że pojawienie się obcych bakterii zniekształci wyniki badań analizowanego szczepu.
5. Poziom wilgotności. Wskaźnik ten, wraz z konsystencją podłoża, powinien mieć optymalne właściwości dla określonego typu bakterii.
6. Potencjał redoks (RH2). Pokazuje stosunek substancji oddających i akceptujących elektrony, a także poziom nasycenia tlenem pożywki. W przypadku tlenowców i beztlenowców warunki hodowli bakterii różnią się nieco w tym wskaźniku. Mikroorganizmy beztlenowe rozmnażają się najlepiej przy wartościach RH2 poniżej 5, a mikroorganizmy tlenowe co najmniej 10.
7. Jednolitość. Ważne jest, aby pożywka zawierała stałe ilości poszczególnych składników. Ponadto preferowane są przejrzyste rozwiązania, które ułatwiają monitorowanie wzrostu upraw lub zauważanie zanieczyszczenia.

Rodzaje mediów kulturowych

Na wybór konkretnego podłoża do hodowli drobnoustrojów ma wpływ wiele czynników, między innymi charakterystyka ich odżywiania oraz cel badań. Główne cechy leżące u podstaw klasyfikacji pożywek to:

1. Składniki. Według substancji wyjściowych użytych do stworzenia podłoża rozróżniają:

• naturalne, które są przygotowywane z produktów pochodzenia zwierzęcego lub roślinnego (np. mięso, mleko, owoce) i nadają się do uprawy mieszanejuprawy;
• półsyntetyczny, w którym drogie naturalne produkty spożywcze zastępowane są produktami niespożywczymi (na przykład mączka kostna, skrzepy krwi) i które są optymalne do hodowli niektórych rodzajów bakterii lub izolowania ich produktów przemiany materii z środowisko;
• syntetyczne, które są przygotowywane z precyzyjnych ilości związków chemicznych, mają znany stały skład i są łatwe do odtworzenia.

2. Konsystencja (gęstość). Rozróżnij środowiska:

• ciecz;
• gęsty;
• półpłynny.

Dwa ostatnie są przygotowywane ze specjalnych roztworów lub płynnych substancji z dodatkiem agaru lub żelatyny, aby uzyskać wymaganą gęstość. Ponadto gęstym środowiskiem dla rozwoju bakterii jest zakrzepła surowica krwi, ziemniaki, pożywka z żelem krzemionkowym, karagen.

3. Pogarszać. Na tej podstawie środowiskami są:

• proste, których lista jest krótka, to bulion mięsny peptonowy (MBB), bulion i agar Hottingera, agar mięsny peptonowy (MPA), odżywcza żelatyna i woda peptonowa.
• kompleksowy, przygotowany z prostych składników z dodatkiem krwi, serwatki, węglowodanów i innych substancji.

4. Wizyta, umówione spotkanie. Wyróżnia się następujące pożywki:

• main są używane do hodowli wielu patogennych drobnoustrojów (zwykle prosta kompozycja);
• specjalne służą do izolowania i hodowli bakterii, które nie rosną na prostych podłożach;
• selektywne (są również selektywne) są odpowiednie do izolowania określonego rodzaju bakterii i hamowania wzrostu powiązanych drobnoustrojów (selektywnośćutworzone przez dodanie do pożywki określonych substancji, takich jak antybiotyki lub sole, lub poprzez dostosowanie pH);
• Diagnostyka różnicowa umożliwia odróżnienie jednego rodzaju bakterii od drugiego poprzez ocenę aktywności enzymatycznej np. podłoża;
• konserwanty są potrzebne do początkowej inokulacji z późniejszym transportem próbek, ponieważ zapobiegają śmierci mikroorganizmów, a także hamują wzrost innych bakterii.

Przygotowanie mediów

Najważniejszym krokiem w hodowli bakterii beztlenowych jest przygotowanie odpowiedniej pożywki. Po wybraniu optymalnych parametrów przejdź do następujących etapów:

• ważenie, poprzez wybór próbki składników na wadze analitycznej;
• rozpuszczanie przeprowadza się w wodzie destylowanej podgrzanej do 70 °C, a fosforany, mikro- i makrosole są rozpuszczane oddzielnie;
• gotowanie w łaźni wodnej przez dwie minuty;
• oznaczanie pH za pomocą papierka wskaźnikowego lub potencjometru;
• filtracja przez mokrą tkaninę lub filtry papierowe w przypadku płynnych i stopionych gęstych podłoży oraz przez filtr z bawełnianej gazy w przypadku podłoży agarowych;
• butelkowanie wykonane na 3/4 pojemności;
• sterylizacja zależna od medium;
• kontrola sterylności odbywa się poprzez ustawienie na dwa dni w termostacie, a następnie obserwację;
• kontrola chemiczna w celu ustalenia pH i zawartości niezbędnychprzedmioty;
• kontrola biologiczna przez próbne zaszczepienie.

Sterylizacja szkła i mediów

Jedną z podstawowych zasad hodowli bakterii jest sterylność. Wzrost i rozwój obcych mikroorganizmów może wpływać na właściwości pożywki poprzez zmianę jej składu chemicznego i pH. Sterylizacja jest głównym warunkiem hodowli czystych kultur. W praktyce termin ten oznacza metody niszczenia absolutnie wszystkich form życia na powierzchni iw objętości wysterylizowanych przedmiotów. Naczynia, użyte narzędzia, pożywki i inne przedmioty używane podczas badania są sterylizowane.

Niektóre rodzaje sterylizacji:

• Zapalenie. Sterylizacja pętli i igieł do wysiewu, szkiełek podstawowych, niektóre narzędzia można wykonać za pomocą palnika lub lampy spirytusowej.
• Wrzenie. Nadaje się do obsługi strzykawek, igieł, żywności, ale nie zabija przetrwalników bakterii.
• Sterylizacja na sucho. Przeprowadzany jest w specjalnej szafie suszącej i nadaje się do obróbki kolb, probówek i innych wyrobów szklanych laboratoryjnych.
• Sterylizacja parowa. Przeprowadzana w autoklawie metoda ta jest bardzo skuteczna. Ale nie nadaje się do pożywek zawierających białka lub jakiekolwiek inne związki, które rozkładają się w wysokich temperaturach. Większą oszczędność można nazwać tyndalizacją. Odbywa się w kotle Kocha i łączy kiełkowanie zarodników z ich niszczeniem.
• Pasteryzacja. Stosuje się go do mediów zmieniających swoje właściwości po zagotowaniu (np. mleko, wino, piwo), zdolnych dopozbądź się mikroorganizmów nie przenoszących zarodników. Temperatura przetwarzania wynosi tylko 50-60 ° C przez piętnaście do trzydziestu minut. W niektórych przypadkach stosowana jest sterylizacja na zimno, przeprowadzana przy użyciu filtrów lub promieni UV.

Warunki uprawy bakterii

Wzrost i rozwój bakterii jest możliwy tylko pod pewnymi czynnikami i wartościami każdego z nich:

1. Temperatura. Istnieją trzy grupy bakterii, które różnią się preferencjami temperaturowymi:

• termofile lub drobnoustroje kochające ciepło rosną w temperaturze 45-90°C, co oznacza, że nie rozmnażają się w organizmach ludzkich i zwierzęcych;
• psychrofile, czyli kochające zimno mikroorganizmy, preferują temperatury w zakresie 5-15 °C i są hodowane w chłodniach;
• mezofile, rozwijają się w temperaturze 25-37 ° C, zawierają większość bakterii.

2. Lekki. Jest to cecha hodowli bakterii fototroficznych, ponieważ przeprowadzają one proces fotosyntezy. Ale dla większości drobnoustrojów oświetlenie nie jest warunkiem wstępnym. I nawet na odwrót, ultrafiolet słoneczny może hamować ich rozwój.

3. Woda. Wszystkie mikroorganizmy potrzebują wody w dostępnej (płynnej) postaci. Właśnie dlatego mrożona żywność ma niewielki lub żaden rozwój bakterii.

4. Zakwaszenie środowiska. Ta zasada hodowli bakterii została już szczegółowo omówiona powyżej.

5. Napowietrzanie. Tlen jako pierwiastek chemiczny jest integralną częścią wody i znaczną liczbą związków wykorzystywanych dohodowla mikroorganizmów. Tlen gazowy może być również zawarty w wodzie i innych cieczach w postaci rozpuszczonej. Znaczna część bakterii potrzebuje stałego zaopatrzenia w cząsteczki tlenu. Ale dla wielu mikroorganizmów jest to niepotrzebne lub, co gorsza, gazowy tlen jest dla nich toksyczny, ponieważ nie mają katalazy i peroksydazy, które niszczą toksyczne produkty oddechowe. Dlatego najważniejszym krokiem w hodowli bakterii beztlenowych jest usuwanie cząsteczek O₂ z pożywki.

6. Hodowla mikroorganizmów. Hodowla bakterii tlenowych i beztlenowych odbywa się w różnych warstwach środowiska i w różnych trybach.

Hodowla mikroorganizmów tlenowych

Hodowla bakterii tlenowych wymaga tlenu cząsteczkowego. W celu uzyskania czystych kultur tlenowców, które mogą być z powodzeniem stosowane w medycynie i przemyśle spożywczym, stosuje się następujące metody:

• powierzchnia rosnąca na gęstych podłożach lub w podłożach płynnych (ich cienka warstwa), gdy tlen pochodzi bezpośrednio z powietrza;
• Głęboka uprawa w pożywkach płynnych, gdy wzrost ilości rozpuszczonego w nich tlenu uzyskuje się poprzez ciągłe napowietrzanie.

Hodowla mikroorganizmów beztlenowych

Podstawową zasadą hodowli tego typu bakterii jest ich minimalny kontakt z tlenem atmosferycznym. Zapewnienie warunków do ich wzrostu jest znacznie trudniejsze niż aerobom. Następujące metody są używane do izolacji beztlenowców z molekularnego O₂:

1. Fizyczne. Ta metoda hodowli bakterii beztlenowych sprowadza się do ich hodowli w specjalnym aparacie próżniowym – mikroanaerostat. Zawarte w nim powietrze zostaje zastąpione specjalną mieszanką gazową azotu z dodatkiem 10% wodoru i 5% dwutlenku węgla.
2. Chemiczne. Obejmują one: stosowanie środków pochłaniających (np. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) lub środki redukujące (takie jak kwas askorbinowy).
3. Biologiczne. Sprowadza się to do wspólnej uprawy tlenowców i beztlenowców w systemie zamkniętym. Ta metoda hodowli bakterii polega na zasianiu jednej połowy szalki Petriego niektórymi tlenowymi gatunkami bakterii, a drugiej połowy badanym beztlenowcem. Jego rozwój rozpocznie się w momencie, gdy cały tlen zostanie zużyty.

Do hodowli bakterii beztlenowych odpowiednie są następujące metody wysiewu:

• w warstwie powierzchniowej;
• w warstwie powierzchniowej wypełnionej sterylną parafiną;
• w gęstej, gęstej pożywce;
• w głębokich warstwach lepkich mediów.

Pozyskiwanie czystej kultury

Mikrobiolodzy zwykle pracują z próbkami zamieszkałymi przez wiele różnych rodzajów drobnoustrojów. Jednak aby określić systematyczną pozycję drobnoustrojów (rodzina, rodzaj, gatunek), a także zbadać ich cechy, konieczne jest ich wyizolowanie i wyhodowanie czystej kultury. Mają ogromne znaczenie w wielu gałęziach przemysłu spożywczego np. serowego, chlebowego, kwasu chlebowego, wina itp. Hodowla bakterii kwasu mlekowego umożliwia uzyskanieniezbędny składnik do produkcji fermentowanych produktów mlecznych, ciasta, kakao, kiszonki, a nawet tworzyw sztucznych.

Metoda izolacji czystej kultury w gęstym podłożu opiera się na mechanicznym oddzieleniu komórek drobnoustrojów i ich późniejszej izolowanej hodowli. Próbkę przenosi się do sterylnej objętości wody lub soli fizjologicznej (objętość 10-100 ml), a następnie wstrząsa przez dwie minuty. W celu wyekstrahowania drobnoustrojów znajdujących się w grubości badanego materiału (np. kiełbasy lub sera) najpierw naciera się kawałki próbek sterylnymi narzędziami z piaskiem. Materiał poddany wstępnemu przygotowaniu, o wadze 1 g lub objętości 1 ml, rozcieńcza się sterylną wodą 10, 100, 1000 itd. razy. Dobierany jest stopień rozcieńczenia, który daje stężenie komórek odpowiadające możliwościom metody.

Następna hodowla mikroorganizmów polega na przygotowaniu pożywki. Zwykle wybiera się gęste medium (MPA). Najpierw jest topiony i schładzany do 45-50 °C, a dopiero potem przelewany do kilku szalek Petriego (trzy do pięciu sztuk), na których dnie umieszczane są waciki z badanej substancji o różnych stężeniach. Następnie następuje wymieszanie jeszcze niezamrożonej pożywki z wprowadzonym do niej materiałem. W ten sposób komórki są utrwalane w różnych punktach objętości podłoża.

Następnie szalki Petriego umieszcza się w termostacie na 2 dni w temperaturze 22 °C. W tym czasie komórki namnażają się do tego stopnia, że kolonia utworzona przez każdą z komórek staje się widoczna gołym okiem. Każdy z nich to czysta kultura typu bakterii, z których komórek pochodziróża.

Następnie, z szalek Petriego, mikroorganizmy są przeszczepiane do oddzielnych probówek wypełnionych pożywką. W ten sposób z mieszanej próbki izoluje się czyste kultury. Ta metoda nosi imię jej twórcy - R. Kocha. Jest to również powszechnie nazywane metodą kubkową lub siewem zubożonym. Po uzyskaniu czystych kultur różnych typów bakterii określa się ich kształt, zarodniki i rodziny.

Wszystkie prace muszą być wykonywane zgodnie z zasadami aseptyki. Aby uniknąć przedwczesnego rozwoju drobnoustrojów, badanie należy przeprowadzić natychmiast po pobraniu próbki. Woda wodociągowa jest analizowana po spuszczeniu pierwszych porcji, ponieważ mogą zawierać drobnoustroje nagromadzone w rurach i kranach. Mikroflora owoców, jagód i warzyw znajduje się głównie na powierzchni (skórka), dlatego z niej wykonuje się mycie. Aby to zrobić, umieść płód w sterylnym pojemniku i napełnij go wymaganą ilością wody. Następnie dość energicznie wstrząsa się, a wodę przelewa do innego naczynia. Plony z wyrobów tekstylnych również pozyskuje się w wacikach, ale wcześniej wycina się z nich kawałki o określonym rozmiarze.