Absorpcja i dalsza reemisja światła przez media nieorganiczne i organiczne jest wynikiem fosforescencji lub fluorescencji. Różnica między tymi zjawiskami to długość odstępu między pochłanianiem światła a emisją strumienia. Przy fluorescencji procesy te zachodzą niemal jednocześnie, a przy fosforescencji z pewnym opóźnieniem.
Tło historyczne
W 1852 roku brytyjski naukowiec Stokes po raz pierwszy opisał fluorescencję. Ukuł nowy termin w wyniku swoich eksperymentów z fluorytem, który emitował czerwone światło pod wpływem światła ultrafioletowego. Stokes zauważył ciekawe zjawisko. Odkrył, że długość fali światła fluorescencyjnego jest zawsze dłuższa niż światła wzbudzającego.
W XIX wieku przeprowadzono wiele eksperymentów w celu potwierdzenia hipotezy. Wykazali, że różne próbki fluoryzują pod wpływem światła ultrafioletowego. Wśród materiałów znalazły się m.in. kryształy, żywice, minerały, chlorofil,surowce lecznicze, związki nieorganiczne, witaminy, oleje. Bezpośrednie użycie barwników do analizy biologicznej rozpoczęło się dopiero w 1930 roku
Opis mikroskopii fluorescencyjnej
Niektóre materiały użyte w badaniach w pierwszej połowie XX wieku były bardzo specyficzne. Dzięki wskaźnikom, których nie można było osiągnąć metodami kontrastowymi, metoda mikroskopii fluorescencyjnej stała się ważnym narzędziem zarówno w badaniach biomedycznych, jak i biologicznych. Otrzymane wyniki miały niemałe znaczenie dla materiałoznawstwa.
Jakie są zalety mikroskopii fluorescencyjnej? Przy pomocy nowych materiałów możliwe stało się wyizolowanie wysoce specyficznych komórek i składników submikroskopowych. Mikroskop fluorescencyjny pozwala na wykrycie pojedynczych cząsteczek. Różnorodność barwników pozwala na identyfikację kilku elementów jednocześnie. Chociaż rozdzielczość przestrzenna sprzętu jest ograniczona przez granicę dyfrakcji, która z kolei zależy od specyficznych właściwości próbki, wykrywanie cząsteczek poniżej tego poziomu jest również całkiem możliwe. Różne próbki wykazują autofluorescencję po napromieniowaniu. Zjawisko to jest szeroko stosowane w petrologii, botanice, przemyśle półprzewodników.
Funkcje
Badanie tkanek zwierzęcych lub mikroorganizmów chorobotwórczych jest często komplikowane przez zbyt słabą lub bardzo silną niespecyficzną autofluorescencję. Jednak wartość wbadania polegają na wprowadzeniu do materiału składników wzbudzanych o określonej długości fali i emitujących strumień świetlny o wymaganym natężeniu. Fluorochromy działają jak barwniki zdolne do samoprzyczepiania się do struktur (niewidocznych lub widocznych). Jednocześnie wyróżnia je wysoka selektywność względem celów i wydajności kwantowej.
Mikroskopia fluorescencyjna stała się szeroko stosowana wraz z pojawieniem się naturalnych i syntetycznych barwników. Miały określone profile emisji i intensywności wzbudzenia i były ukierunkowane na określone cele biologiczne.
Identyfikacja pojedynczych cząsteczek
Często w idealnych warunkach można zarejestrować blask pojedynczego elementu. W tym celu konieczne jest m.in. zapewnienie odpowiednio niskiego poziomu szumów czujki oraz tła optycznego. Cząsteczka fluoresceiny może emitować do 300 000 fotonów przed zniszczeniem w wyniku fotowybielania. Przy 20% zbieralności i wydajności procesu można je zarejestrować w ilości około 60 tys.
Mikroskopia fluorescencyjna, oparta na fotodiodach lawinowych lub mnożeniu elektronów, pozwoliła naukowcom obserwować zachowanie poszczególnych cząsteczek przez sekundy, a w niektórych przypadkach nawet minuty.
Trudności
Kluczowym problemem jest tłumienie szumów tła optycznego. Ze względu na to, że wiele materiałów użytych do budowy filtrów i soczewek wykazuje pewną autofluorescencję, wysiłki naukowców w początkowych etapach koncentrowały się na wydaniukomponenty o niskiej fluorescencji. Jednak kolejne eksperymenty doprowadziły do nowych wniosków. W szczególności stwierdzono, że mikroskopia fluorescencyjna oparta na całkowitym odbiciu wewnętrznym pozwala uzyskać niski poziom tła i wysoką moc wzbudzenia światła.
Mechanizm
Zasady mikroskopii fluorescencyjnej opartej na całkowitym odbiciu wewnętrznym polegają na wykorzystaniu szybko zanikającej lub nierozchodzącej się fali. Powstaje na styku mediów o różnych współczynnikach załamania. W tym przypadku wiązka światła przechodzi przez pryzmat. Posiada wysoki współczynnik załamania światła.
Pryzmat sąsiaduje z roztworem wodnym lub szkłem o niskich parametrach. Jeżeli wiązka światła jest skierowana na nią pod kątem większym niż kąt krytyczny, wiązka zostaje całkowicie odbita od interfejsu. Zjawisko to z kolei powoduje powstanie fali nierozchodzącej się. Innymi słowy, generowane jest pole elektromagnetyczne, które penetruje ośrodek o niższym współczynniku załamania w odległości mniejszej niż 200 nanometrów.
W nierozchodzącej się fali natężenie światła będzie wystarczające do wzbudzenia fluoroforów. Jednak ze względu na wyjątkowo płytką głębokość jego objętość będzie bardzo mała. Rezultatem jest tło niskiego poziomu.
Modyfikacja
Mikroskopia fluorescencyjna oparta na całkowitym odbiciu wewnętrznym może być zrealizowana z użyciem epi-iluminacji. Wymaga to soczewek o zwiększonej aperturze numerycznej (co najmniej 1,4, ale pożądane jest, aby sięgała 1,45-1,6), a także częściowo oświetlonego pola aparatu. To ostatnie osiąga się za pomocą małej plamki. Dla większej jednorodności stosuje się cienki pierścień, przez który blokowana jest część przepływu. Aby uzyskać krytyczny kąt, po którym następuje całkowite odbicie, potrzebny jest wysoki poziom załamania środka immersyjnego w soczewkach i szkiełku nakrywkowym mikroskopu.
