Podczas badania substancji w chemii organicznej stosuje się kilkanaście różnych reakcji jakościowych w celu określenia zawartości niektórych związków. Taka analiza wizualna pozwala od razu zrozumieć, czy niezbędne substancje są obecne, a jeśli ich nie ma, można znacznie ograniczyć dalsze eksperymenty w celu ich identyfikacji. Reakcje te obejmują ninhydrynę, która jest główną reakcją w wizualnym oznaczaniu związków aminowych.
Co to jest?
Ninhydryna jest związkiem dikarbonylowym zawierającym jeden pierścień aromatyczny z przyłączonym do niego heterocyklem, którego drugi atom ma 2 grupy hydroksylowe (OH-). Substancja ta jest otrzymywana przez bezpośrednie utlenianie inandionu - 1, 3, a zatem zgodnie z międzynarodową nomenklaturą ma następującą nazwę: 2, 2 - dihydroksyinandion -1, 3 (ryc. 1).
Czysta ninhydryna to żółty lub biały kryształkolory, które po podgrzaniu dobrze rozpuszczają się w wodzie i innych polarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak aceton. Jest to dość szkodliwa substancja, w kontakcie ze skórą lub błonami śluzowymi w dużych ilościach powoduje podrażnienia, także przy wdychaniu. Pracuj z tym związkiem ostrożnie i tylko w rękawiczkach, ponieważ w kontakcie ze skórą reaguje z białkami komórek skóry i zabarwia ją na fioletowo.
Substancje reaktywne
Jak wspomniano powyżej, reakcja ninhydrynowa służy przede wszystkim do wizualnego oznaczania zawartości związków aminowych:
- α-aminokwasy (w tym w białkach);
- aminocukry;
- alkaloidy zawierające grupy –NH2 i -NH;
- różne aminy.
Należy zauważyć, że aminy drugorzędowe i trzeciorzędowe czasami reagują bardzo słabo, więc potrzeba więcej badań, aby potwierdzić ich obecność.
Do oznaczania ilościowego stosowane są różne metody chromatografii, na przykład chromatografia bibułowa (BC), chromatografia cienkowarstwowa (TLC) lub płukanie nośników stałych roztworem ninhydryny w różnych mediach.
Ta reakcja nie jest specyficzna dla związków aminowych, ponieważ odczynnik może wejść do niej wszystkimi na raz. Jednak ze strony produktów reakcji ma to osobliwość w postaci uwalniania bąbelków dwutlenku węgla (CO2) i jest to typowe tylko w przypadku interakcji z α-amino kwasy.
Cechy mechanizmu
BW literaturze istnieją różne interpretacje równania reakcji z ninhydryną. Niektórzy badacze pomijają powstawanie hydrindantyny z 2-aminoinandionu, który przy udziale amoniaku i ninhydryny tworzy również substancję barwiącą zwaną „fioletą Ruemana” (lub „błękitem Ruemana”), podczas gdy inni wręcz przeciwnie zakładają tylko jego udział bez obecności pośrednich produktów aminowych. W zapisie samej reakcji jest również kilka interesujących punktów, w szczególności dotyczy to metod przyłączania pochodnej aminowej ninhydryny do jej głównej cząsteczki w celu wytworzenia barwnika. Wątpliwe pozostaje również wskazanie miejsca „chodzącego wodoru” otrzymanego przez pośrednią aminę z ośrodka wodnego: może on znajdować się albo w grupie ketonowej, albo obok –NH2.
W rzeczywistości niuans z atomem H jest nieznaczny, ponieważ jego pozycja w związku nie odgrywa szczególnej roli w przebiegu reakcji, więc nie należy na to zwracać uwagi. Jeśli chodzi o pominięcie jednego z możliwych etapów, przyczyna leży tu w aspekcie teoretycznym: do tej pory dokładny mechanizm powstawania purpury Ruemana nie został dokładnie określony, można więc znaleźć zupełnie inne schematy reakcji z ninhydryną.
Najpełniejszy możliwy przebieg interakcji odczynnika ze związkami aminowymi zostanie zaproponowany poniżej.
Mechanizm reakcji
Po pierwsze, ninhydryna oddziałuje z α-aminokwasem, wiążąc go w miejscu rozszczepienia grup hydroksylowych i tworząc produkt kondensacji (ryc. 2a). Następnie ten ostatni ulega zniszczeniu, uwalniając pośrednią aminę, aldehyd i dwutlenek węgla (rys. 2b). Od produktu końcowego po dołączeniuninhydryna, syntetyzowana jest struktura purpury Ruemana (diketonhydrindenketohydrinamine, ryc. 2c). Wskazuje się również na możliwe tworzenie się hydrindantyny (zredukowanej ninhydryny) z pośredniej aminy, która również zamienia się w związek barwiący w obecności amoniaku (dokładniej wodorotlenku amonu) z nadmiarem samego odczynnika (rys. 2d).
Tworzenie hydrindantyny zostało udowodnione przez samego Ruemana, gdy siarkowodór oddziałuje na cząsteczkę ninhydryny. Związek ten jest w stanie rozpuścić się w węglanie sodu Na2CO3, zabarwiając roztwór na ciemnoczerwony. A po dodaniu rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego hydrindantyna wytrąca się.
Najprawdopodobniej pośrednia amina, hydridantyna, ninhydryna i struktura barwnika, ze względu na ich niestabilność po podgrzaniu, znajdują się w pewnej równowadze, co pozwala na obecność kilku dodatkowych etapów.
Ten mechanizm jest odpowiedni do wyjaśnienia reakcji ninhydryny z innymi związkami aminowymi, z wyjątkiem produktów ubocznych wynikających z eliminacji reszty struktury z –NH2, -NH lub -N.
Test Biureta i inne reakcje na białka
Analiza jakościowa wiązań peptydowych nawet struktur niebiałkowych może odbywać się nie tylko przy udziale powyższego odczynnika. Natomiast w przypadku reakcji ninhydrynowej z białkami oddziaływanie nie zachodzi wzdłuż grup –CO-NH‒, ale wzdłuż grup aminowych. Istnieje tak zwana „reakcja biuretowa”, która charakteryzuje się dodaniem jonów do roztworu ze związkami aminowymimiedź dwuwartościowa z CuSO4 lub Cu(OH)2 w środowisku alkalicznym (rys. 3).
Podczas analizy, w obecności niezbędnych struktur, roztwór zmienia kolor na ciemnoniebieski z powodu wiązania wiązań peptydowych w kompleks barwny, który odróżnia jeden odczynnik od drugiego. Dlatego reakcje biuretu i ninhydryny są uniwersalne w stosunku do struktur białkowych i niebiałkowych z grupą –CO-NH‒.
Podczas oznaczania aminokwasów cyklicznych stosuje się reakcję ksantoproteinową ze stężonym roztworem kwasu azotowego HNO3 , który po znitrowaniu daje żółty kolor. Kropla odczynnika na skórze ma również żółty kolor, reagując z aminokwasami w komórkach skóry. Kwas azotowy może powodować oparzenia i należy się z nim obchodzić również w rękawiczkach.
Przykłady interakcji ze związkami aminowymi
Reakcja ninhydryny dla α-aminokwasów daje dobry efekt wizualny, z wyjątkiem struktur barwnych proliny i hydroksyproliny, które reagują tworząc żółty kolor. Możliwe wyjaśnienie tego efektu znaleziono w innych warunkach środowiskowych interakcji ninhydryny z tymi strukturami.
Reakcja z grupą aminową
Ponieważ test nie jest specyficzny, wizualne wykrycie alaniny za pomocą reakcji ninhydrynowej w mieszaninie nie jest możliwe. Natomiast metodą chromatografii bibułowej, nakładając próbki różnych α-aminokwasów, spryskując je wodnym roztworem ninhydryny i rozwijając w specjalnym medium, możnaobliczyć skład ilościowy nie tylko zastrzeganego związku, ale także wielu innych.
Schematycznie oddziaływanie alaniny z ninhydryną przebiega według tej samej zasady. Przyłącza się do odczynnika na grupie aminowej i pod wpływem aktywnych jonów hydroniowych (H3O+) ulega odszczepieniu na węglu -wiązanie azotowe rozkładające się na aldehyd octowy (CH3COH) i dwutlenek węgla (CO2). Kolejna cząsteczka ninhydryny przyłącza się do azotu, wypierając cząsteczki wody i tworzy się struktura barwiąca (ryc. 4).
Reakcja z heterocyklicznym związkiem aminowym
Reakcja ninhydryny z proliną jest specyficzna, szczególnie w analizach chromatograficznych, ponieważ takie struktury w środowisku kwaśnym najpierw żółkną, a następnie stają się fioletowe w środowisku obojętnym. Naukowcy tłumaczą to cechą rearanżacji cyklu w związku pośrednim, na którą wpływa właśnie obecność dużej liczby protonów wodoru, które uzupełniają zewnętrzny poziom energii azotu.
Zniszczenie heterocyklu nie następuje, a kolejna cząsteczka ninhydryny jest do niego przyłączona przy 4 atomie węgla. Po dalszym ogrzewaniu uzyskana struktura w obojętnym podłożu zamienia się w purpurę Ruemana (ryc. 5).
Przygotowanie głównego odczynnika
Test ninhydrynowy przeprowadza się z różnymi roztworami, w zależności od rozpuszczenia struktur aminowych w niektórych organicznych izwiązki nieorganiczne.
Głównym odczynnikiem jest przygotowanie 0,2% roztworu w wodzie. Jest to wszechstronna mieszanina, ponieważ większość związków dobrze rozpuszcza się w H2O. Aby otrzymać świeżo przygotowany odczynnik, próbkę 0,2 g chemicznie czystej ninhydryny rozcieńcza się w 100 ml wody.
Warto zauważyć, że dla niektórych analizowanych roztworów to stężenie jest niewystarczające, więc można przygotować roztwory 1% lub 2%. Jest to typowe dla ekstraktów z surowców leczniczych, ponieważ zawierają one różne klasy związków aminowych.
Podczas prowadzenia badań chromatograficznych roztwory, na przykład podczas przemywania mieszaniny na stałym nośniku przez kolumnę, można przygotować w alkoholu, sulfotlenku dimetylu, acetonie i innych rozpuszczalnikach polarnych - wszystko będzie zależeć od rozpuszczalnika niektórych struktury aminowe.
Aplikacja
Reakcja z ninhydryną umożliwia wykrycie wielu związków aminowych w roztworze, co czyni ją jedną z pierwszych do zastosowania w jakościowej analizie substancji organicznych. Wizualna determinacja znacznie zmniejsza liczbę eksperymentów, zwłaszcza przy analizie słabo zbadanych roślin, leków i postaci dawkowania, a także nieznanych roztworów i mieszanin.
W kryminalistyce metoda ta jest szeroko stosowana do określania obecności śladów potu na każdej powierzchni.
Nawet pomimo niespecyficzności reakcji, wycofanie reakcji ninhydrynowej z praktyki chemicznej jest niemożliwe, ponieważzastąpienie tej substancji mniej toksycznymi analogami (np. oksolinem) dowiodło, że mają one słabszą wrażliwość na grupy aminowe i nie dają dobrych wyników w analizach fotometrycznych.
