W różnicowym oznaczaniu enterobakterii i niektórych wibratorów reakcja Vogesa-Proskauera zajmuje szczególne miejsce. Test opiera się na zdolności bakterii do fermentacji glukozy z wytworzeniem acetoiny.
Istota procesu badawczego
W mikrobiologii reakcja Vogesa-Proskauera jest często wykorzystywana do różnicowania w obrębie rodziny Yersinia enterobakterii (w tym patogenów pseudotuberculosis i enterocolitis), Escherichia coli i tlenowców tworzących zarodniki. Wynik jest wizualizowany poprzez zabarwienie podłoża po dodaniu określonych odczynników.
Ten test należy do serii IMViC (skrót od Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate) - grupy testów identyfikacyjnych zawierających definicje różnicowe:
- z indolem, w oparciu o rozkład tryptofanu na indol, stosowany w obecności odczynnika Kovacsa lub Ehrlicha;
- używaniemetyloroth, czyli czerwień metylowa, która wykrywa dane pH w wyniku metabolizmu glukozy;
- Reakcje Vogesa-Proskauera do wykrywania acetylo-metylokarbinolu;
- utylizacja cytrynianu ze zmianą koloru w wyniku alkalizacji pożywki.
Istotą procesu jest wizualizacja obecności zdiagnozowanych bakterii dzięki interakcji utworzonej przez nie acetoiny z żrącym potasem w obecności tlenu. Acetylo-metylokarbinol jest utleniany do diacetylu, który tworzy jasnoczerwony lub różowy związek. Zwiększ czułość testu, wprowadzając alfa-naftol przed dodaniem potażu żrącego.
Ustawienie testu
Sformułowanie reakcji Vogesa-Proskauera obejmuje wstępną hodowlę mikroorganizmów. Czystą kulturę wysiewa się na zróżnicowane podłoże diagnostyczne Clarka, którego odmianą jest bulion Clarka (bez dodatku agar-agar). Stosowane jest albo gotowe podłoże, albo przygotowywane niezależnie. Składniki obejmują:
- 5g peptonu;
- 5g glukozy;
- 5g dwuzasadowego fosforanu potasu;
- 1L destylatu.
Podczas badania kultura jest inokulowana sterylną ezą bakteriologiczną do płynnej pożywki. Ilość - 5 ml w probówce plus kontrola. Inkubację prowadzi się w temperaturze 35-37 stopni przez dwa dni. Następnie prowadzone jest etapowe badanie reakcji Vogesa-Proskauera:
- 2, 5 ml kultury bulionowej przenosi się do sterylnej probówki.
- Dodaj sześć kropli alfa-naftolu (5% roztwór alkoholu).
- Dodaj 40%roztwór kaustycznego potasu w ilości 0,1 ml lub dwie krople.
- Mieszanie przeprowadza się przez delikatne potrząsanie probówką.
- Oceń wynik po 15 minutach od rozpoczęcia eksperymentu.
Alternatywną metodą testową jest inkubacja przez noc, której czas jest skrócony do 18 godzin lub do jednego dnia. Oprócz tej metody stosuje się również ekspresowy test: kulturę wprowadza się w pętli do 2 ml pożywki, inkubuje przez około cztery godziny, następnie dodaje się odczynniki w równej ilości 2-3 kropli, miesza i wynik jest oceniany po dziesięciu minutach.
Kontrola jest jednym z czynników wywołujących zapalenie płuc Klebsiella pneumoniae - szczep atcc 13883.
Ocena wyniku
Po wymaganym czasie po dodaniu odczynników (od 5 do 15 minut) powinno się zaobserwować kolor wiśniowo-czerwony z wyraźną reakcją dodatnią, czerwony i różowy - z reakcją słabo dodatnią. Żadna zmiana nie jest rejestrowana jako wynik negatywny.
Nadmiar potażu żrącego w roztworze może dawać imitację reakcji pozytywnej, barwiąc się na kolor miedziany. W takim przypadku należy odnotować negatywną odpowiedź badanej kolonii. Barwienie miedzią pojawia się również w przypadkach, gdy ocenę przeprowadza się godzinę po wprowadzeniu odczynników.
Oceniając wynik, należy wziąć pod uwagę, że przedłużona hodowla badanych mikroorganizmów (ponad trzy dni) prowadzi do zakwaszenia podłoża, co może prowadzić do nieprawidłowego wyniku badania. Reakcja może być łagodnie pozytywna lubfałszywie negatywny.
Wymagania dotyczące odczynników testowych
Odczynniki Voges-Proskauer muszą spełniać wymagania, takie jak prawidłowe stężenie, wysoka czystość i stabilność, co jest osiągane dzięki odpowiedniemu przechowywaniu.
Gotowe do użycia zestawy testowe zazwyczaj zawierają odczynniki do 100 lub więcej zastosowań i są dostarczane w plastikowych lub przyciemnionych fiolkach. Jakość reguluje odpowiednia dokumentacja.
