Białko jest niezbędnym składnikiem wszystkich organizmów. Każda z jego cząsteczek składa się z jednego lub więcej łańcuchów polipeptydowych składających się z aminokwasów. Chociaż informacja niezbędna do życia jest zakodowana w DNA lub RNA, rekombinowane białka pełnią szeroki zakres funkcji biologicznych w organizmach, w tym katalizę enzymatyczną, ochronę, wsparcie, ruch i regulację. W zależności od pełnionych funkcji w organizmie substancje te można podzielić na różne kategorie, takie jak przeciwciała, enzymy, składnik strukturalny. Biorąc pod uwagę ich ważne funkcje, związki te były intensywnie badane i szeroko stosowane.
W przeszłości głównym sposobem uzyskania rekombinowanego białka było wyizolowanie go z naturalnego źródła, co zwykle jest nieefektywne i czasochłonne. Ostatnie postępy w biologicznej technologii molekularnej umożliwiły klonowanie DNA kodującego określony zestaw substancji do wektora ekspresyjnego dla substancji takich jak bakterie, drożdże, komórki owadów i komórki ssaków.
Mówiąc prosto, rekombinowane białka są tłumaczone przez egzogenne produkty DNA dożywe komórki. Uzyskanie ich zazwyczaj obejmuje dwa główne kroki:
- Klonowanie cząsteczki.
- Ekspresja białek.
Obecnie produkcja takiej struktury jest jedną z najpotężniejszych metod stosowanych w medycynie i biologii. Kompozycja ma szerokie zastosowanie w badaniach i biotechnologii.
Dyrekcja medyczna
Rekombinowane białka zapewniają ważne leczenie różnych chorób, takich jak cukrzyca, nowotwory, choroby zakaźne, hemofilia i anemia. Typowe preparaty takich substancji obejmują przeciwciała, hormony, interleukiny, enzymy i antykoagulanty. Istnieje rosnące zapotrzebowanie na preparaty rekombinowane do użytku terapeutycznego. Pozwalają poszerzyć metody leczenia.
genetycznie modyfikowane rekombinowane białka odgrywają kluczową rolę na rynku leków terapeutycznych. Komórki ssaków wytwarzają obecnie najwięcej środków terapeutycznych, ponieważ ich preparaty są zdolne do wytwarzania wysokiej jakości substancji podobnych do naturalnych. Ponadto wiele zatwierdzonych rekombinowanych białek terapeutycznych jest wytwarzanych w E. coli ze względu na dobrą genetykę, szybki wzrost i wysoką produktywność. Ma również pozytywny wpływ na rozwój leków opartych na tej substancji.
Badania
Otrzymywanie rekombinowanych białek opiera się na różnych metodach. Substancje pomagają poznać podstawowe i podstawowe zasady organizmu. Cząsteczki te można wykorzystać do identyfikacji i określenialokalizacja substancji zakodowanej przez konkretny gen oraz ujawnienie funkcji innych genów w różnych aktywnościach komórkowych, takich jak sygnalizacja komórkowa, metabolizm, wzrost, replikacja i śmierć, transkrypcja, translacja i modyfikacja związków omówionych w artykule.
Zatem obserwowany skład jest często wykorzystywany w biologii molekularnej, biologii komórki, biochemii, badaniach strukturalnych i biofizycznych oraz w wielu innych dziedzinach nauki. Jednocześnie pozyskiwanie białek rekombinowanych jest praktyką międzynarodową.
Takie związki są użytecznymi narzędziami w zrozumieniu interakcji międzykomórkowych. Okazały się skuteczne w kilku metodach laboratoryjnych, takich jak ELISA i immunohistochemia (IHC). Rekombinowane białka można wykorzystać do opracowania testów enzymatycznych. W połączeniu z parą odpowiednich przeciwciał, komórki mogą być używane jako standardy dla nowych technologii.
Biotechnologia
Rekombinowane białka zawierające sekwencję aminokwasową są również wykorzystywane w przemyśle, produkcji żywności, rolnictwie i bioinżynierii. Na przykład w hodowli zwierząt enzymy można dodawać do żywności, aby zwiększyć wartość odżywczą składników pasz, zmniejszyć koszty i odpady, wspierać zdrowie jelit zwierząt, poprawiać produktywność i poprawiać stan środowiska.
Ponadto bakterie kwasu mlekowego (LAB) przez długi czaszostały wykorzystane do produkcji sfermentowanej żywności, a ostatnio opracowano LAB do ekspresji rekombinowanych białek zawierających sekwencję aminokwasową, które mogą być szeroko stosowane, na przykład do poprawy trawienia ludzi, zwierząt i żywienia.
Jednak te substancje mają również ograniczenia:
- W niektórych przypadkach produkcja rekombinowanych białek jest złożona, kosztowna i czasochłonna.
- Substancje wytwarzane w komórkach mogą nie pasować do naturalnych form. Ta różnica może zmniejszać skuteczność terapeutycznych białek rekombinowanych, a nawet powodować skutki uboczne. Ponadto ta różnica może wpłynąć na wyniki eksperymentów.
- Głównym problemem wszystkich leków rekombinowanych jest immunogenność. Wszystkie produkty biotechnologiczne mogą wykazywać pewną formę immunogenności. Trudno przewidzieć bezpieczeństwo nowych białek terapeutycznych.
Ogólnie rzecz biorąc, postępy w biotechnologii zwiększyły i ułatwiły produkcję rekombinowanych białek do różnych zastosowań. Chociaż nadal mają pewne wady, są ważne w medycynie, badaniach naukowych i biotechnologii.
Link do choroby
rekombinowane białko nie jest szkodliwe dla ludzi. Jest tylko integralną częścią całej cząsteczki w rozwoju konkretnego leku lub elementu odżywczego. Wiele badań medycznych wykazało, że wymuszona ekspresja białka FGFBP3 (w skrócie BP3) w laboratoryjnym szczepie otyłych myszy wykazała znaczną redukcję tkanki tłuszczowej.masy, pomimo genetycznej predyspozycji do stosowania.
Wyniki tych badań pokazują, że białko FGFBP3 może zaoferować nową terapię zaburzeń związanych z zespołem metabolicznym, takich jak cukrzyca typu 2 i stłuszczenie wątroby. Ale ponieważ BP3 jest naturalnym białkiem, a nie sztucznym lekiem, badania kliniczne rekombinowanego ludzkiego BP3 mogą rozpocząć się po ostatniej rundzie badań przedklinicznych. To znaczy istnieją powody związane z bezpieczeństwem prowadzenia takich badań. Rekombinowane białko nie jest szkodliwe dla ludzi dzięki stopniowemu przetwarzaniu i oczyszczaniu. Zmiany zachodzą również na poziomie molekularnym.
PD-L2, jeden z kluczowych graczy w immunoterapii, został nominowany do Nagrody Nobla 2018 w dziedzinie fizjologii lub medycyny. Praca ta, rozpoczęta przez prof. Jamesa P. Allisona z USA i prof. Tasuku Honjo z Japonii, doprowadziła do leczenia nowotworów, takich jak czerniak, rak płuc i innych, w oparciu o immunoterapię punktów kontrolnych. Niedawno AMSBIO dodała do swojej linii immunoterapii ważny nowy produkt, aktywator PD-L2/TCR – CHO Recombinant Cell Line.
Podczas eksperymentów sprawdzających słuszność koncepcji naukowcy z Uniwersytetu Alabama w Birmingham, kierowani przez dr H. Longa Zhenga, profesora Roberta B. Adamsa i dyrektora ds. medycyny laboratoryjnej na wydziale patologii UAB School of Medycyna zwróciła uwagę na potencjalną terapię rzadkiego, ale śmiertelnego zaburzenia krwawienia, TTP.
Wyniki tegobadania pokazują po raz pierwszy, że transfuzja płytek krwi obciążonych rADAMTS13 może być nowym i potencjalnie skutecznym podejściem terapeutycznym do zakrzepicy tętniczej związanej z wrodzoną i immunizacyjną TTP.
Rekombinowane białko to nie tylko składnik odżywczy, ale także lek w składzie opracowywanego leku. To tylko kilka dziedzin, które obecnie zajmują się medycyną i dotyczą badania wszystkich jej elementów strukturalnych. Jak pokazuje praktyka międzynarodowa, struktura substancji umożliwia na poziomie molekularnym radzenie sobie z wieloma poważnymi problemami w ludzkim ciele.
Opracowanie szczepionek
Rekombinowane białko to specyficzny zestaw cząsteczek, które można modelować. Podobną właściwość wykorzystuje się przy opracowywaniu szczepionek. Naukowcy z Uniwersytetu w Edynburgu i Pirbright Institute twierdzą, że nowa strategia szczepień, znana również jako zastosowanie specjalnego zastrzyku zrekombinowanego wirusa, może ochronić miliony kurczaków zagrożonych poważnymi chorobami układu oddechowego. Te szczepionki wykorzystują nieszkodliwe lub słabe wersje wirusa lub bakterii do wprowadzania zarazków do komórek organizmu. W tym przypadku eksperci wykorzystali rekombinowane wirusy z różnymi białkami kolców jako szczepionki, aby stworzyć dwie wersje nieszkodliwego wirusa. Istnieje wiele różnych leków opartych na tym połączeniu.
Nazwy handlowe i analogi rekombinowanych białek są następujące:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Są to głównie leki przeciwnowotworowe, ale istnieją inne obszary leczenia związane z tą substancją czynną.
Nowa szczepionka, zwana również LASSARAB, zaprojektowana w celu ochrony ludzi zarówno przed gorączką Lassa, jak i wścieklizną, wykazała obiecujące wyniki w badaniach przedklinicznych, zgodnie z nowym badaniem opublikowanym w czasopiśmie naukowym Nature Communications. Kandydat na inaktywowaną rekombinowaną szczepionkę wykorzystuje osłabiony wirus wścieklizny.
Zespół badawczy umieścił materiał genetyczny wirusa Lassa w wektorze wirusa wścieklizny, aby szczepionka eksprymowała białka powierzchniowe zarówno w komórkach Lassy, jak i wściekliźnie. Te związki powierzchniowe wywołują odpowiedź immunologiczną przeciwko czynnikom zakaźnym. Ta szczepionka została następnie inaktywowana w celu „zniszczenia” żywego wirusa wścieklizny użytego do wytworzenia nośnika.
Pobieranie metod
Istnieje kilka systemów produkcji substancji. Ogólna metoda otrzymywania rekombinowanego białka opiera się na uzyskaniu materiału biologicznego z syntezy. Ale są inne sposoby.
Obecnie istnieje pięć głównych systemów ekspresji:
- System ekspresji E. coli.
- System odciągania drożdży.
- System ekspresji komórek owadów.
- System ekspresji komórek ssaków.
- Bezkomórkowy system ekspresji białek.
Ta ostatnia opcja jest szczególnie odpowiednia do ekspresji białek transbłonowychi związki toksyczne. W ostatnich latach substancje, które są trudne do ekspresji konwencjonalnymi metodami wewnątrzkomórkowymi, zostały z powodzeniem włączone do komórek in vitro. Na Białorusi szeroko stosowana jest produkcja białek rekombinowanych. Istnieje wiele przedsiębiorstw państwowych zajmujących się tym problemem.
Cell Free Protein Synthesis System to szybka i wydajna metoda syntezy substancji docelowych poprzez dodanie różnych substratów i związków energetycznych niezbędnych do transkrypcji i translacji w systemie enzymatycznym ekstraktów komórkowych. W ostatnich latach stopniowo pojawiły się zalety metod bezkomórkowych dla rodzajów substancji, takich jak złożone, toksyczne membrany, co dowodzi ich potencjalnego zastosowania w dziedzinie biofarmaceutycznej.
Technologia bezkomórkowa umożliwia łatwe i kontrolowane dodawanie różnych niewystępujących naturalnie aminokwasów w celu uzyskania złożonych procesów modyfikacji, które są trudne do rozwiązania po konwencjonalnej ekspresji rekombinacyjnej. Takie metody mają dużą wartość aplikacyjną i potencjał do dostarczania leków i opracowywania szczepionek przy użyciu cząstek wirusopodobnych. Duża liczba białek błonowych została z powodzeniem wyrażona w wolnych komórkach.
Ekspresja kompozycji
Rekombinowane białko CFP10-ESAT 6 jest produkowane i wykorzystywane do tworzenia szczepionek. Taki alergen gruźlicy pozwala wzmocnić układ odpornościowy i rozwinąć przeciwciała. Ogólnie rzecz biorąc, badania molekularne obejmują badanie dowolnego aspektu białka, takiego jak struktura, funkcja, modyfikacje, lokalizacja lub interakcje. Odkrywaćw jaki sposób określone substancje regulują procesy wewnętrzne, naukowcy zwykle potrzebują środków do wytworzenia interesujących i korzystnych związków funkcjonalnych.
Biorąc pod uwagę wielkość i złożoność białek, synteza chemiczna nie jest realną opcją dla tego przedsięwzięcia. Zamiast tego żywe komórki i ich maszyneria komórkowa są zwykle wykorzystywane jako fabryki do tworzenia i konstruowania substancji na podstawie dostarczonych szablonów genetycznych. System ekspresji rekombinowanego białka generuje następnie strukturę niezbędną do wytworzenia leku. Następnie następuje wybór niezbędnego materiału dla różnych kategorii leków.
W przeciwieństwie do białek, DNA można łatwo skonstruować syntetycznie lub in vitro przy użyciu dobrze znanych technik rekombinacji. Dlatego też matryce DNA określonych genów, z dodanymi sekwencjami reporterowymi lub sekwencjami znaczników powinowactwa lub bez nich, można zaprojektować jako matryce do ekspresji monitorowanej substancji. Takie związki pochodzące z takich matryc DNA nazywane są białkami rekombinowanymi.
Tradycyjne strategie ekspresji substancji obejmują transfekcję komórek wektorem DNA zawierającym szablon, a następnie hodowanie komórek w celu transkrypcji i translacji pożądanego białka. Zazwyczaj komórki poddaje się następnie lizie w celu wyekstrahowania eksprymowanego związku do późniejszego oczyszczenia. Rekombinowane białko CFP10-ESAT6 jest przetwarzane w ten sposób i przechodzi przez system oczyszczania z możliwychpowstawanie toksyn. Dopiero potem zostaje zsyntetyzowany w szczepionkę.
Szeroko stosowane są zarówno prokariotyczne, jak i eukariotyczne systemy ekspresji in vivo dla substancji molekularnych. Wybór systemu zależy od rodzaju białka, wymogu aktywności funkcjonalnej i pożądanej wydajności. Te systemy ekspresji obejmują ssaki, owady, drożdże, bakterie, glony i komórki. Każdy system ma swoje zalety i wyzwania, a wybór odpowiedniego systemu do konkretnego zastosowania jest ważny dla pomyślnej ekspresji badanej substancji.
Ekspresja od ssaków
Zastosowanie białek rekombinowanych umożliwia opracowywanie szczepionek i leków na różnych poziomach. W tym celu można zastosować tę metodę otrzymywania substancji. Systemy ekspresji ssaków mogą być wykorzystywane do wytwarzania białek z królestwa zwierząt, które mają najbardziej natywną strukturę i aktywność ze względu na ich fizjologicznie istotne środowisko. Skutkuje to wysokim poziomem przetwarzania potranslacyjnego i aktywności funkcjonalnej. Systemy ekspresyjne ssaków można stosować do wytwarzania przeciwciał, złożonych białek i związków do stosowania w komórkowych testach funkcjonalnych. Jednak korzyści te są połączone z bardziej rygorystycznymi warunkami hodowli.
Ssacze systemy ekspresji mogą być stosowane do generowania białek przejściowo lub poprzez stabilne linie komórkowe, w których konstrukt ekspresyjny jest zintegrowany z genomem gospodarza. Chociaż takie systemy mogą być używane w wielu eksperymentach, czasprodukcja może wygenerować dużą ilość substancji w ciągu jednego do dwóch tygodni. Ten rodzaj biotechnologii rekombinowanych białek jest bardzo poszukiwany.
Te przejściowe, wysokowydajne systemy ekspresji ssaków wykorzystują kultury zawiesinowe i mogą dawać gramy na litr. Ponadto białka te mają więcej natywnych fałdowań i modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, w porównaniu z innymi systemami ekspresyjnymi.
Wyrażenie owada
Metody wytwarzania rekombinowanego białka nie ograniczają się do ssaków. Istnieją również bardziej produktywne sposoby pod względem kosztów produkcji, chociaż wydajność substancji na 1 litr uzdatnianej cieczy jest znacznie niższa.
Komórki owadzie mogą być używane do ekspresji białka o wysokim poziomie z modyfikacjami podobnymi do systemów ssaków. Istnieje kilka systemów, które można wykorzystać do wygenerowania rekombinowanego bakulowirusa, który następnie można wykorzystać do ekstrakcji interesującej substancji z komórek owadów.
Ekspresje rekombinowanych białek można łatwo zwiększać i dostosowywać do hodowli zawiesinowych o wysokiej gęstości w celu łączenia cząsteczek na dużą skalę. Są one bardziej funkcjonalnie podobne do rodzimego składu materii ssaków. Chociaż wydajność może wynosić do 500 mg/l, wytwarzanie rekombinowanego bakulowirusa może być czasochłonne, a warunki hodowli są trudniejsze niż w przypadku systemów prokariotycznych. Jednak w bardziej południowych i cieplejszych krajach podobnemetoda jest uważana za bardziej wydajną.
Ekspresja bakteryjna
Produkcję rekombinowanych białek można ustalić przy pomocy bakterii. Ta technologia znacznie różni się od opisanych powyżej. Bakteryjne systemy ekspresji białek są popularne, ponieważ bakterie są łatwe w hodowli, szybko rosną i dają wysoką wydajność rekombinowanej formulacji. Jednak wielodomenowe substancje eukariotyczne wyrażane w bakteriach są często niefunkcjonalne, ponieważ komórki nie są przystosowane do wykonywania niezbędnych modyfikacji potranslacyjnych lub fałdowania molekularnego.
Ponadto wiele białek staje się nierozpuszczalnych jako cząsteczki inkluzyjne, które są bardzo trudne do odzyskania bez ostrych denaturatorów i późniejszych uciążliwych procedur ponownego fałdowania cząsteczek. Ta metoda jest w większości uważana za nadal w dużej mierze eksperymentalna.
Wyrażenie wolne od komórek
Rekombinowane białko zawierające sekwencję aminokwasową stafylokinazy otrzymuje się w nieco inny sposób. Znajduje się w wielu rodzajach zastrzyków, przed użyciem wymaga kilku systemów.
Ekspresja białek wolnych od komórek to synteza substancji in vitro przy użyciu translacyjnych ekstraktów z całych komórek. W zasadzie ekstrakty z całych komórek zawierają wszystkie makrocząsteczki i składniki wymagane do transkrypcji, translacji, a nawet modyfikacji potranslacyjnej.
Te składniki obejmują polimerazę RNA, regulatorowe czynniki białkowe, formy transkrypcyjne, rybosomy i tRNA. Podczas dodawaniakofaktory, nukleotydy i specyficzna matryca genów, te ekstrakty mogą syntetyzować interesujące białka w ciągu kilku godzin.
Chociaż nie są one zrównoważone w produkcji na dużą skalę, systemy bezkomórkowe lub do ekspresji białek in vitro (IVT) oferują szereg zalet w porównaniu z konwencjonalnymi systemami in vivo.
Ekspresja bezkomórkowa umożliwia szybką syntezę rekombinowanych preparatów bez angażowania hodowli komórkowej. Systemy bezkomórkowe umożliwiają znakowanie białek zmodyfikowanymi aminokwasami, a także ekspresję związków ulegających szybkiej degradacji proteolitycznej przez wewnątrzkomórkowe proteazy. Ponadto, łatwiej jest jednocześnie eksprymować wiele różnych białek przy użyciu metody bezkomórkowej (na przykład testowanie mutacji białek poprzez ekspresję na małą skalę z wielu różnych matryc rekombinowanego DNA). W tym reprezentatywnym eksperymencie zastosowano system IVT do ekspresji ludzkiego białka kaspazy-3.
Wnioski i perspektywy na przyszłość
Produkcję białek rekombinowanych można teraz postrzegać jako dojrzałą dyscyplinę. Jest to wynik licznych stopniowych ulepszeń w oczyszczaniu i analizie. Obecnie programy odkrywania leków rzadko są wstrzymywane z powodu niemożności wytworzenia docelowego białka. Równoległe procesy ekspresji, oczyszczania i analizy kilku rekombinowanych substancji są obecnie dobrze znane w wielu laboratoriach na całym świecie.
Kompleksy białkowe i rosnący sukces w produkcjisolubilizowane struktury membran będą wymagały więcej zmian, aby nadążyć za popytem. Pojawienie się efektywnych kontraktowych organizacji badawczych zajmujących się bardziej regularnymi dostawami białek pozwoli na realokację zasobów naukowych w celu sprostania tym nowym wyzwaniom.
Ponadto równoległe przepływy pracy powinny umożliwiać tworzenie kompletnych bibliotek monitorowanej substancji, aby umożliwić identyfikację nowych celów i zaawansowane badania przesiewowe, wraz z tradycyjnymi projektami odkrywania leków małocząsteczkowych.
