Barwienie Grama jest szeroko stosowane w mikrobiologii, ponieważ jest to jeden z najłatwiejszych sposobów różnicowania bakterii na podstawie składu ich ściany komórkowej. Według Grama wszystkie bakterie można podzielić na Gram-dodatnie (Gram (+)) i Gram-ujemne (Gram (-)). Metoda barwienia metodą Grama została opracowana w 1884 roku i od tego czasu nie straciła na popularności, chociaż była kilkakrotnie modyfikowana.
Struktura ściany komórkowej
Barwienie Grama pokazuje, czy bakteria jest Gram-dodatnia czy Gram-ujemna. Podział bakterii na Gram (+) i Gram (-) odbywa się zgodnie ze strukturą ich ściany komórkowej.
Ściana komórkowa zawiera największą ilość peptydoglikanu (mureiny) – złożonej substancji zawierającej peptyd i glikan. Glikan składa się z naprzemiennych reszt N-acetyloglukozaminy i kwasu N-acetylomuraminowego połączonych ze sobą przez β-1,Wiązania 4-glikozydowe. Peptydoglikan zapewnia utrzymanie kształtu komórek, ochronę osmotyczną i funkcje antygenowe.
Główne różnice między bakteriami Gram-dodatnimi i Gram-ujemnymi
Różne bakterie mają różną grubość warstwy peptydoglikanu. U bakterii zaklasyfikowanych jako gram-dodatnie waha się od 15 do 80 nm, natomiast u bakterii gram-ujemnych od 2 do 8 nm. Jednocześnie bakterie Gram-ujemne mają specjalną strukturę pod warstwą peptydoglikanu, której nie mają bakterie Gram-dodatnie - przestrzeń peryplazmatyczną. Ta przestrzeń jest wypełniona enzymami hydrolitycznymi - β-laktamazą, rybonukleazą 1, fosfatazą. To właśnie te enzymy są odpowiedzialne za odporność bakterii Gram-ujemnych na wiele antybiotyków.
Warstwa bakterii Gram(-) peptydoglikanu jest związana z lipopolisacharydem, strukturą antygenową zawierającą endotoksynę. W bakteriach Gram(+) kwasy teichoic pełnią podobne funkcje.
Bakterie Gram-ujemne mają dodatkową strukturę - błonę zewnętrzną.
Istota metody barwienia
Przed rozpoczęciem barwienia przygotowywane są rozmazy badanych bakterii. W tym celu na szkiełko wkrapla się wodę i dodaje się tam kulturę mikroorganizmów z pętlą bakteryjną. Następnie, po całkowitym wyschnięciu wody, rozmaz jest utrwalany - szklany szkiełko przesuwa się kilkakrotnie nad płomieniem palnika. Barwienie metodą Grama jest skuteczniejsze niż barwienie żywych bakterii - cząsteczki barwnika lepiej wiążą się z martwymi komórkami.
Kolorowanie odbywa się w kilku etapach:
- Małe kawałki bibuły są umieszczane na utrwalonej rozmazie i wlewa się główny barwnik - fiolet gencjanowy lub błękit metylenowy.
- Po 3-5 minutach usuń kolorową bibułę filtracyjną i wypełnij rozmaz płynem Lugola przez 1 minutę. W takim przypadku preparat ciemnieje.
- Roztwór Lugola jest odsączany, a rozmaz traktowany czystym alkoholem etylowym: kilka kropel nakrapla się na preparat, odsącza się po 20 sekundach. Procedurę powtarza się 2-3 razy.
- Wypłucz szkiełko preparatem testowym wodą destylowaną.
- Dodaj dodatkowe zabarwienie - zakończ preparat fuksyną. Po 1-2 minutach barwnik jest zmywany.
- Po wyschnięciu wody zbadaj rozmaz pod mikroskopem. Bakterie Gram-dodatnie będą niebieskofioletowe, bakterie Gram-ujemne będą różowe lub czerwone.
Przyczyny różnych wzorów barwienia
Jak opisano powyżej, barwienie bakterii Gramem barwi bakterie Gram-dodatnie na niebiesko-fioletowo, a bakterie Gram-ujemne na czerwono lub różowo. Powodem zróżnicowanego barwienia bakterii tą metodą jest to, że po wniknięciu rozpuszczalnej formy fioletu gencjany do komórki, barwnik przechodzi w nierozpuszczalną formę jodu. Podczas traktowania bakterii alkoholem etylowym, lipidy są ekstrahowane z błony pod działaniem tego niepolarnego rozpuszczalnika. Membrana staje się wtedy porowata i nie stanowi już znaczącej bariery dla ługowania barwnika. Jednakżepeptydoglikan jest bardziej odporny na rozpuszczalniki niepolarne, w tym alkohol. To on zapobiega wypłukiwaniu barwnika, dzięki czemu bakterie z grubą warstwą mureiny zmieniają kolor na niebiesko-fioletowy (gram-dodatni), a po potraktowaniu alkoholem nie zmieniają koloru.
Cienka warstwa murein bakterii Gram-ujemnych nie może zatrzymać molekuł barwnika w komórce, więc po działaniu alkoholu stają się bezbarwne - barwią Gram-ujemne.
Po ekspozycji rozmazu na fuksynę, bakterie Gram-barwione pozostają niebiesko-fioletowe, podczas gdy bakterie Gram-ujemne stają się różowo-czerwone.
Przykłady bakterii Gram(+) i Gram(-)
Bakterie Gram-ujemne obejmują cyjanobakterie, bakterie siarkowe, bakterie żelazowe, chlamydie, riketsje, bakterie octowe, wiele metylobakterii, bakterie tionowe, arseniobakterie, karboksybakterie.
Bifidobakterie, wiele bakterii wodnych, paciorkowce i gronkowce są Gram-dodatnie.
