Kultura komórkowa jest silnie uzależniona od warunków. Różnią się one dla każdego typu komórki, ale zwykle składają się z odpowiedniego naczynia z podłożem lub podłożem, które dostarcza niezbędnych składników odżywczych (aminokwasy, węglowodany, witaminy, minerały), czynników wzrostu, hormonów i gazów (CO2, O2) i reguluje fizykę -środowisko chemiczne (pH buforu, ciśnienie osmotyczne, temperatura). Większość komórek wymaga podłoża powierzchniowego lub sztucznego (hodowla adhezyjna lub jednowarstwowa), podczas gdy inne można swobodnie rozmnażać w pożywce hodowlanej (hodowla w zawiesinie). Długość życia większości komórek jest uwarunkowana genetycznie, ale niektóre kultury komórkowe zostały przekształcone w nieśmiertelne komórki, które będą się rozmnażać w nieskończoność, jeśli zostaną stworzone optymalne warunki.
Definicja
Sdefinicja tutaj jest dość prosta. W praktyce termin „hodowla komórkowa” odnosi się obecnie do hodowli komórek pochodzących z wielokomórkowych eukariotów, zwłaszcza komórek zwierzęcych, w przeciwieństwie do innych typów hodowli. Rozwój historyczny i metody hodowli są ściśle związane z kulturą tkankową i kulturą narządów. Hodowla wirusów jest również powiązana z komórkami jako żywicielami wirusów.
Historia
Techniki laboratoryjne pozyskiwania i hodowli komórek oddzielonych od oryginalnego źródła tkanki stały się bardziej solidne w połowie XX wieku. Głównego przełomu w tej dziedzinie dokonali naukowcy z Yale University.
Przełom w połowie stulecia
Początkowo pozyskiwanie i hodowanie komórek było praktykowane w celu znalezienia panaceum na wiele niebezpiecznych wirusów. Wielu badaczy odkryło, że wiele szczepów wirusów może bezpiecznie żyć, rozwijać się i namnażać na sztucznie wyhodowanych komórkach zwierzęcych, a nawet na całych organach, które są autonomicznie trzymane w specjalnych butelkach. Z reguły do takich testów wykorzystuje się komórki organów zwierząt, które są jak najbliżej człowieka – np. wyższych naczelnych, takich jak szympansy. Wszystkie te odkrycia zostały dokonane w latach 40. XX wieku, kiedy eksperymenty na ludziach były z pewnych powodów najbardziej istotne.
Metodologia
Komórki można izolować z tkanek do hodowli ex vivo na kilka sposobów. Można je łatwo usunąć z krwi, ale tylko białe krwinki są zdolne do wzrostu w kulturze. Komórki mogąbyć izolowane z tkanek stałych przez trawienie macierzy zewnątrzkomórkowej przy użyciu enzymów, takich jak kolagenaza, trypsyna lub pronaza przed wstrząsaniem tkanki w celu uwolnienia komórek do zawiesiny. Alternatywnie, kawałki tkanki można umieścić w pożywce wzrostowej, a rosnące komórki są dostępne do hodowli. Ta metoda jest znana jako kultura eksplantatów.
Komórki hodowane bezpośrednio od podmiotu są znane jako komórki pierwotne. Z wyjątkiem niektórych pochodzących z guzów, większość pierwotnych kultur komórkowych ma ograniczoną żywotność.
Nieśmiertelni i komórki macierzyste
Ustalona lub unieśmiertelniona linia komórkowa nabyła zdolność do reprodukcji w nieskończoność, poprzez losową mutację lub celową modyfikację, taką jak sztuczna ekspresja genu telomerazy. Liczne linie komórkowe są dobrze znane jako typowe typy komórek.
Masowa hodowla linii komórek zwierzęcych ma fundamentalne znaczenie dla produkcji szczepionek wirusowych i innych produktów biotechnologicznych. Hodowla ludzkich komórek macierzystych służy do zwiększania ich liczby i różnicowania komórek na różne typy nadające się do przeszczepu. Hodowla komórek ludzkich (macierzystych) jest również wykorzystywana do zbierania cząsteczek i egzosomów uwalnianych przez komórki macierzyste w celach terapeutycznych.
Połączenie z genetyką
Produkty biologiczne wytwarzane technologią rekombinacji DNA (rDNA) w kulturach zwierzęcych obejmująenzymy, syntetyczne hormony, immunobiologiczne (przeciwciała monoklonalne, interleukiny, limfokiny) i przeciwnowotworowe. Podczas gdy wiele prostszych białek można wytworzyć przy użyciu rDNA w kulturach bakteryjnych, bardziej złożone białka, które są glikozylowane (modyfikowane węglowodanami) muszą być obecnie wytwarzane w komórkach zwierzęcych.
Ważnym przykładem tak złożonego białka jest hormon erytropoetyna. Koszty hodowli kultur komórek ssaków są wysokie, dlatego trwają badania nad stworzeniem tak złożonych białek w komórkach owadów lub roślinach wyższych. Jednym z jego zastosowań jest wykorzystanie pojedynczych komórek embrionalnych i zarodków somatycznych jako źródła bezpośredniego transferu genów poprzez bombardowanie cząsteczkami, ekspresję genów przejściowych oraz mikroskopię konfokalną. Hodowla komórek roślinnych jest najczęstszą formą tej praktyki.
Kultury tkankowe
Kultura tkankowa to hodowla tkanek lub komórek oddzielonych od organizmu. Proces ten jest zwykle ułatwiony przy użyciu płynnej, półstałej lub stałej pożywki wzrostowej, takiej jak bulion lub agar. Hodowla tkankowa ogólnie odnosi się do hodowli komórek i tkanek zwierzęcych, z bardziej specyficznym terminem używanym dla roślin, komórek roślinnych i hodowli tkankowych. Termin „kultura tkankowa” został ukuty przez amerykańskiego patologa Montrose'a Thomasa Burroughsa.
Historia hodowli tkankowej
W 1885 roku Wilhelm Roux usunął część rdzenia kręgowegopłytki z płodowym kurczakiem i utrzymywane w ciepłym roztworze soli przez kilka dni, ustalając podstawową zasadę hodowli tkankowej. W 1907 zoolog Ross Granville Harrison zademonstrował wzrost komórek embrionalnych żaby, które dały początek komórkom nerwowym w zakrzepłej limfie. W 1913 E. Steinhardt, C. Israel i RA Lambert wyhodowali wirusa krowianki we fragmentach tkanki rogu świnki morskiej. To było już coś znacznie bardziej zaawansowanego niż kultura komórek roślinnych.
Od przeszłości do przyszłości
Gotlieb Haberlandt jako pierwszy zwrócił uwagę na możliwość hodowli izolowanych tkanek roślinnych. Zasugerował, że ta metoda może określić możliwości poszczególnych komórek poprzez hodowlę tkankową, a także wzajemny wpływ tkanek na siebie. Gdy zrealizowano pierwotne twierdzenia Haberlanda, zaczęto aktywnie stosować techniki hodowli tkanek i komórek, prowadząc do nowych odkryć w biologii i medycynie. Jego pierwotny pomysł, przedstawiony w 1902 roku, nazwano totipotencjalnością: „Teoretycznie wszystkie komórki roślinne są zdolne do wytworzenia kompletnej rośliny”. Hodowla kultur komórkowych w tym czasie znacznie się rozwinęła.
We współczesnym zastosowaniu kultura tkankowa ogólnie odnosi się do wzrostu komórek z tkanki organizmu wielokomórkowego in vitro. W tym przypadku warunki hodowli komórek nie są bardzo ważne. Komórki te mogą być izolowane z organizmu dawcy, komórek pierwotnych lub unieśmiertelnionych linii komórkowych. Komórki myją siępodłoże hodowlane, które zawiera składniki odżywcze i źródła energii niezbędne do ich przetrwania. Termin „kultura tkankowa” jest często używany zamiennie z kulturą komórkową.
Aplikacja
Dosłowne znaczenie kultury tkankowej odnosi się do hodowli fragmentów tkanki, tj. kultury eksplantatów.
Kultura tkankowa jest ważnym narzędziem do badania biologii komórek organizmów wielokomórkowych. Zapewnia model tkanki in vitro w dobrze zdefiniowanym środowisku, którym można łatwo manipulować i analizować.
W hodowli tkanek zwierzęcych komórki mogą być hodowane jako jednowarstwowe 2D (kultura konwencjonalna) lub wewnątrz włóknistych rusztowań lub żeli, aby uzyskać bardziej naturalistyczne struktury przypominające tkankę 3D (hodowla 3D). Eric Simon w raporcie z grantu NIH SBIR z 1988 r. wykazał, że elektroprzędzenie może być wykorzystywane do produkcji rusztowań z włókien polimerowych w skali nano i submikronowej, specjalnie zaprojektowanych do stosowania jako substraty komórkowe i tkankowe in vitro.
To wczesne zastosowanie przewodzących elektrycznie siatek z włókien do hodowli komórek i inżynierii tkankowej pokazało, że różne typy komórek będą przylegać i rozmnażać się na włóknach poliwęglanowych. Zaobserwowano, że w przeciwieństwie do spłaszczonej morfologii typowej dla hodowli 2D, komórki hodowane na włóknach przewodu elektrycznego wykazują bardziej zaokrągloną morfologię 3D typową dla tkanek in vivo.
Kulturaw szczególności tkanka roślinna jest związana z hodowaniem całych roślin z małych kawałków włókien roślinnych hodowanych na podłożu.
Różnice w modelach
Badania w inżynierii tkankowej, komórkach macierzystych i biologii molekularnej obejmują głównie hodowlę kultur komórkowych na płaskich plastikowych szalkach. Metoda ta jest znana jako dwuwymiarowa (2D) hodowla komórkowa i została po raz pierwszy opracowana przez Wilhelma Rouxa, który w 1885 roku usunął część płytki rdzeniowej zarodkowego kurczaka i trzymał ją w ciepłej soli fizjologicznej przez kilka dni na płaskim szkle.
Z postępu technologii polimerów wyłoniła się nowoczesna standardowa plastikowa szalka do dwuwymiarowej hodowli komórek, powszechnie znana jako szalka Petriego. Julius Richard Petri, niemiecki bakteriolog, zwykle przypisywany w literaturze naukowej jako wynalazca tego wynalazku, pracował jako asystent Roberta Kocha. Obecnie różni badacze również używają kolb do hodowli, rożków, a nawet jednorazowych toreb, takich jak te używane w jednorazowych bioreaktorach.
Poza hodowlą dobrze ugruntowanych unieśmiertelnionych linii komórkowych, komórki z pierwotnych eksplantów wielu organizmów mogą być hodowane przez ograniczony czas, aż do pojawienia się podatności. Hodowane komórki pierwotne są szeroko stosowane w badaniach, jak w przypadku keratocytów ryb w badaniach migracji komórek. Pożywki do hodowli komórkowych można stosować w większościinny.
Hodowle komórek roślinnych są zwykle hodowane jako kultury zawiesinowe komórek w pożywce płynnej lub w hodowlach kalusa na pożywkach stałych. Hodowla niezróżnicowanych komórek roślinnych i kalusów wymaga odpowiedniej równowagi hormonów wzrostu roślin, auksyny i cytokininy.
