Współczesna biologia zadziwia wyjątkowością i skalą swoich odkryć. Dziś ta nauka bada większość procesów, które są ukryte przed naszymi oczami. Jest to niezwykłe dla biologii molekularnej - jednej z obiecujących dziedzin, która pomaga rozwikłać najbardziej złożone tajemnice żywej materii.
Co to jest odwrotna transkrypcja
Odwrotna transkrypcja (w skrócie RT) to specyficzny proces charakterystyczny dla większości wirusów RNA. Jego główną cechą jest synteza dwuniciowej cząsteczki DNA na bazie informacyjnego RNA.
OT nie jest charakterystyczny dla bakterii ani organizmów eukariotycznych. Główny enzym, reversetaza, odgrywa kluczową rolę w syntezie dwuniciowego DNA.
Historia odkryć
Pomysł, że cząsteczka kwasu rybonukleinowego może stać się szablonem do syntezy DNA, był uważany za absurdalny aż do lat 70. XX wieku. Następnie B altimore i Temin, pracując oddzielnie, niemal równocześnie odkryli nowy enzym. Nazwali to polimerazą RNA-zależną-DNA lub odwrotną transkryptazą.
Odkrycie tego enzymu bezwarunkowo potwierdziło istnienie organizmówzdolny do odwrotnej transkrypcji. Obaj naukowcy otrzymali Nagrodę Nobla w 1975 roku. Po pewnym czasie Engelhardt zaproponował alternatywną nazwę dla odwrotnej transkryptazy - rewertaza.
Dlaczego OT jest sprzeczne z centralnym dogmatem biologii molekularnej
Centralny dogmat to koncepcja sekwencyjnej syntezy białek w każdej żywej komórce. Taki schemat zbudowany jest z trzech składników: DNA, RNA i białka.
Zgodnie z centralnym dogmatem RNA może być syntetyzowane wyłącznie na matrycy DNA i tylko wtedy RNA jest zaangażowane w budowanie pierwotnej struktury białka.
Ten dogmat został oficjalnie zaakceptowany w środowisku naukowym przed odkryciem odwrotnej transkrypcji. Nic dziwnego, że pomysł odwrotnej syntezy DNA z RNA od dawna jest odrzucany przez naukowców. Dopiero w 1970 roku wraz z odkryciem reversetazy nastąpił kres tej kwestii, co znalazło odzwierciedlenie w koncepcji syntezy białek.
Odwrócenie retrowirusów ptaków
Proces odwrotnej transkrypcji nie jest kompletny bez udziału polimerazy DNA zależnej od RNA. Rewertaza retrowirusa ptasiego została dotychczas zbadana w maksymalnym stopniu.
Tylko około 40 cząsteczek tego białka można znaleźć w jednym wirionie tej rodziny wirusów. Białko składa się z dwóch podjednostek, które są w równych ilościach i pełnią trzy ważne funkcje reverseazy:
1) Synteza cząsteczki DNA zarówno na jednoniciowej/dwuniciowej matrycy RNA, jak i na bazie kwasów dezoksyrybonukleinowych.
2) Aktywacja RNazy H, której główną rolą jestrozszczepienie cząsteczki RNA w kompleksie RNA-DNA.
3) Zniszczenie odcinków cząsteczek DNA w celu wprowadzenia do genomu eukariotycznego.
Mechanizm OT
Kroki odwrotnej transkrypcji mogą się różnić w zależności od rodziny wirusów, tj. na rodzaj ich kwasów nukleinowych.
Najpierw rozważmy te wirusy, które używają odwrotnej tazy. Tutaj proces OT jest podzielony na 3 kroki:
1) Synteza nici RNA „-” na matrycy „+” nici RNA.
2) Zniszczenie nici „+” RNA w kompleksie RNA-DNA przy użyciu enzymu RNazy H.
3) Synteza dwuniciowej cząsteczki DNA na szablonie „-” łańcucha RNA.
Ta metoda reprodukcji wirionów jest typowa dla niektórych wirusów onkogennych i ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).
Warto zauważyć, że do syntezy dowolnego kwasu nukleinowego na matrycy RNA potrzebne są nasiona lub starter. Starter to krótka sekwencja nukleotydów, która jest komplementarna do końca 3' cząsteczki RNA (szablon) i odgrywa ważną rolę w inicjowaniu syntezy.
Gdy gotowe, dwuniciowe cząsteczki DNA pochodzenia wirusowego zostaną zintegrowane z genomem eukariotycznym, rozpoczyna się zwykły mechanizm syntezy białka wirionowego. W rezultacie komórka „schwytana” przez wirusa staje się fabryką produkcji wirionów, w której w dużych ilościach powstają niezbędne białka i cząsteczki RNA.
Inny sposób odwrotnej transkrypcji opiera się na działaniu syntetazy RNA. Białko to jest aktywne w paramyksowirusach, rabdowirusach, pikornowirusach. W tym przypadku nie ma trzeciego etapu OT - formacjidwuniciowy DNA, a zamiast tego łańcuch RNA „+” jest syntetyzowany na matrycy wirusowego łańcucha RNA „-” i vice versa.
Powtarzanie takich cykli prowadzi zarówno do replikacji genomu wirusa, jak i do powstania mRNA zdolnego do syntezy białek w warunkach zakażonej komórki eukariotycznej.
Biologiczne znaczenie odwrotnej transkrypcji
Proces OT ma ogromne znaczenie w cyklu życiowym wielu wirusów (głównie retrowirusów, takich jak HIV). RNA wirionu, który zaatakował komórkę eukariotyczną, staje się matrycą do syntezy pierwszej nici DNA, na której nie jest trudno ukończyć drugą nić.
Uzyskany dwuniciowy DNA wirusa jest integrowany z genomem eukariotycznym, co prowadzi do aktywacji procesów syntezy białka wirionowego i pojawienia się dużej liczby jego kopii wewnątrz zainfekowanej komórki. To jest główna misja Revertase i ogólnie OT dla wirusa.
Odwrotna transkrypcja może również wystąpić u eukariontów w kontekście retrotranspozonów – ruchomych elementów genetycznych, które mogą niezależnie przenosić się z jednej części genomu do drugiej. Takie pierwiastki, zdaniem naukowców, spowodowały ewolucję organizmów żywych.
Retrotranspozon to odcinek eukariotycznego DNA, który koduje kilka białek. Jeden z nich, reversetaza, jest bezpośrednio zaangażowany w delokalizację takiego retrotransporozonu.
Wykorzystanie OT w nauce
Od momentu wyizolowania reversetazy w czystej postaci proces odwrotnej transkrypcji został przyjęty przez biologów. Badanie mechanizmu OT nadal pomaga w odczytywaniu sekwencji najważniejszych ludzkich białek.
Faktem jest, że genom eukariontów, w tym my, zawiera nieinformacyjne regiony zwane intronami. Kiedy sekwencja nukleotydów jest odczytywana z takiego DNA i powstaje jednoniciowy RNA, ten ostatni traci introny i koduje wyłącznie białka. Jeśli DNA jest syntetyzowane przy użyciu reversetazy na matrycy RNA, łatwo jest je zsekwencjonować i ustalić kolejność nukleotydów.
Kwas nukleinowy utworzony przez odwrotną transkryptazę nazywa się cDNA. Jest często stosowany w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu sztucznego zwiększenia liczby kopii powstałej kopii cDNA. Ta metoda jest stosowana nie tylko w nauce, ale także w medycynie: asystenci laboratoryjni określają podobieństwo takiego DNA z genomami różnych bakterii lub wirusów ze wspólnej biblioteki. Synteza wektorów i ich wprowadzanie do bakterii to jeden z obiecujących obszarów biologii. Jeśli RT jest stosowana do tworzenia DNA ludzi i innych organizmów bez intronów, takie cząsteczki można łatwo wprowadzić do genomu bakterii. Tak więc te ostatnie stają się fabrykami do produkcji substancji niezbędnych dla człowieka (na przykład enzymów).
