Istnieje wiele różnych metod analizy składu i badania właściwości różnych związków i mieszanin substancji. Jedną z takich metod jest chromatografia. Autorstwo w wynalezieniu i zastosowaniu metody należy do rosyjskiego botanika M. S. Tsveta, który na początku XX wieku przeprowadził separację barwników roślinnych.
Definicja i podstawy metody
Chromatografia to fizykochemiczna metoda rozdzielania mieszanin i oznaczania ich składników, oparta na podziale między fazą ruchomą i stacjonarną substancji tworzących mieszaninę (próbka). Faza stacjonarna to porowata substancja stała – sorbent. Może to być również płynny film osadzony na stałej powierzchni. Faza ruchoma – eluent – musi poruszać się wzdłuż fazy stacjonarnej lub przepływać przez nią, filtrowana przez sorbent.
Istotą chromatografii jest to, że różne składniki mieszaniny z konieczności charakteryzują się różnymi właściwościami, takimi jak masa cząsteczkowa, rozpuszczalność, adsorbowalność i tak dalej. W związku z tym szybkość oddziaływania składników fazy ruchomej – sorbatów – ze stacjonarnąnie jest taki sam. Prowadzi to do różnicy prędkości cząsteczek mieszaniny względem fazy stacjonarnej, w wyniku czego składniki są rozdzielane i zagęszczane w różnych strefach sorbentu. Część z nich opuszcza sorbent wraz z fazą ruchomą – są to tzw. składniki niezatrzymane.
Szczególną zaletą chromatografii jest to, że umożliwia szybkie rozdzielanie złożonych mieszanin substancji, także tych o podobnych właściwościach.
Metody klasyfikacji typów chromatografii
Metody użyte w analizie można sklasyfikować według różnych kryteriów. Główny zestaw takich kryteriów jest następujący:
- zagregowany stan faz stacjonarnych i ruchomych;
- fizyczny i chemiczny charakter interakcji sorbentu i sorbinianów;
- jak wprowadzić eluent i go przenieść;
- sposób umieszczenia fazy stacjonarnej, czyli technika chromatograficzna;
- cele chromatograficzne.
Ponadto metody mogą być oparte na różnym charakterze procesu sorpcji, na warunkach technicznych rozdziału chromatograficznego (na przykład niskie lub wysokie ciśnienie).
Przyjrzyjmy się bliżej powyższym głównym kryteriom i najczęściej używanym rodzajom chromatografii z nimi związanym.
Stan skupienia eluentu i sorbentu
Na tej podstawie chromatografia dzieli się na cieczową i gazową. Nazwy metod odzwierciedlają stan fazy mobilnej.
Chromatografia cieczowa to stosowana technikaw procesach rozdzielania mieszanin związków wielkocząsteczkowych, w tym ważnych biologicznie. W zależności od stanu skupienia sorbentu dzieli się na fazę ciecz-ciecz i ciecz-ciało stałe.
Chromatografia gazowa jest następujących typów:
- Adsorpcja gazu (gaz-stała faza), która wykorzystuje stały sorbent, taki jak węgiel, żel krzemionkowy, zeolity lub porowate polimery. Gaz obojętny (argon, hel), azot, dwutlenek węgla pełni rolę eluentu - nośnika rozdzielanej mieszaniny. Oddzielenie lotnych składników mieszaniny odbywa się ze względu na różny stopień ich adsorpcji.
- Gaz-ciecz. Faza stacjonarna w tym przypadku składa się z ciekłego filmu osadzonego na stałym obojętnym podłożu. Składniki próbki są rozdzielane według ich zdolności do adsorpcji lub rozpuszczalności.
Chromatografia gazowa jest szeroko stosowana do analizy mieszanin związków organicznych (z wykorzystaniem produktów ich rozkładu lub pochodnych w postaci gazowej).
Interakcja między sorbentem a sorbinianami
Według tego kryterium rozróżnia się takie typy jak:
- Chromatografia adsorpcyjna, dzięki której mieszaniny są rozdzielane ze względu na różnice w stopniu adsorpcji substancji przez nieruchomy sorbent.
- Dystrybucja. Za jego pomocą rozdzielanie odbywa się na podstawie różnej rozpuszczalności składników mieszaniny. Rozpuszczanie następuje albo w fazie ruchomej i stacjonarnej (w chromatografii cieczowej), albo tylko w fazie stacjonarnej (w gazowo-cieczowejchromatografia).
- Osadnik. Ta metoda chromatograficzna opiera się na różnej rozpuszczalności utworzonych osadów substancji, które mają być oddzielone.
- Wykluczenie lub chromatografia żelowa. Opiera się na różnicy w wielkości cząsteczek, przez co zmienia się ich zdolność wnikania w pory sorbentu, tzw. matrycy żelowej.
- Afiniczny. To specyficzna metoda, która opiera się na specjalnym typie biochemicznego oddziaływania oddzielonych zanieczyszczeń z ligandem, który w fazie stacjonarnej tworzy związek kompleksowy z obojętnym nośnikiem. Ta metoda jest skuteczna w rozdzielaniu mieszanin białkowo-enzymowych i jest powszechna w biochemii.
- Wymiana jonowa. Jako współczynnik separacji próbki metoda ta wykorzystuje różnicę zdolności składników mieszaniny do wymiany jonowej z fazą stacjonarną (jonit). W trakcie tego procesu jony fazy stacjonarnej są zastępowane jonami substancji w składzie eluentu, natomiast ze względu na różne powinowactwo tych ostatnich do wymieniacza jonowego powstaje różnica w szybkości ich ruchu, a co za tym idzie mieszanina jest rozdzielana. Do fazy stacjonarnej najczęściej stosuje się żywice jonowymienne – specjalne polimery syntetyczne.
Chromatografia jonowymienna ma dwie opcje - anionową (zachowuje jony ujemne) i kationową (zatrzymuje odpowiednio jony dodatnie). Ta metoda jest stosowana niezwykle szeroko: w separacji elektrolitów, pierwiastków ziem rzadkich i transuranu, w oczyszczaniu wody, w analizie leków.
Różnica w metodach techniki
Istnieją dwa główne sposoby poruszania się próbki względem fazy stacjonarnej:
- Chromatografia kolumnowa przeprowadza proces separacji w specjalnym urządzeniu - kolumnie chromatograficznej - rurce, w której wewnętrznej wnęce umieszczany jest nieruchomy sorbent. Ze względu na sposób napełniania kolumny dzielą się na dwa typy: upakowane (tzw. „upakowane”) i kapilarne, w których na powierzchnię warstwy nanosi się warstwę sorbentu stałego lub filmu ciekłego fazy stacjonarnej. wewnętrzna ściana. Kolumny upakowane mogą mieć różne kształty: proste, w kształcie litery U, spiralne. Kolumny kapilarne są spiralne.
- Planarna (planarna) chromatografia. W takim przypadku jako nośnik fazy stacjonarnej można zastosować specjalny papier lub płytę (metalową, szklaną lub plastikową), na której osadza się cienka warstwa sorbentu. W tym przypadku metoda chromatograficzna jest określana odpowiednio jako chromatografia papierowa lub cienkowarstwowa.
W przeciwieństwie do metody kolumnowej, w której kolumny chromatograficzne są używane wielokrotnie, w chromatografii planarnej każdy nośnik z warstwą sorbentu może być użyty tylko raz. Proces separacji następuje, gdy płytka lub kartka papieru jest zanurzona w pojemniku z eluentem.
Wprowadzanie i transfer eluentu
Ten czynnik określa charakter ruchu stref chromatograficznych wzdłuż warstwy sorbentu, które powstają podczas rozdzielania mieszaniny. Istnieją następujące metody dostarczania eluentu:
- Przód. Ta metoda jest najprostszatechnika wykonania. Fazą ruchomą jest bezpośrednio sama próbka, która jest w sposób ciągły podawana do kolumny wypełnionej sorbentem. W tym przypadku składnik najmniej zatrzymany, zaadsorbowany gorzej niż inne, porusza się po sorbencie szybciej niż pozostałe. W rezultacie tylko ten pierwszy składnik można wyizolować w czystej postaci, a następnie strefy zawierające mieszaniny składników. Przykładowy rozkład wygląda tak: A; A+B; A+B+C i tak dalej. Chromatografia czołowa nie jest zatem przydatna do rozdzielania mieszanin, ale jest skuteczna w różnych procesach oczyszczania, pod warunkiem, że izolowana substancja ma niską retencję.
- Metoda wypierania różni się tym, że po wejściu do rozdzielanej mieszaniny, do kolumny podawany jest eluent ze specjalnym wypieraczem - substancją charakteryzującą się większą sorbowalnością niż którykolwiek ze składników mieszaniny. Przemieszcza najbardziej zatrzymany element, który wypiera następny i tak dalej. Próbka porusza się wzdłuż kolumny z prędkością wypieracza i tworzy sąsiednie strefy koncentracji. Przy tego typu chromatografii każdy składnik można otrzymać indywidualnie w postaci płynnej na wylocie kolumny.
- Najpowszechniejsza jest metoda eluentu (wywoływania). W przeciwieństwie do metody wypierania, eluent (nośnik) ma w tym przypadku mniejszą sorbowalność niż składniki próbki. Jest on w sposób ciągły przepuszczany przez warstwę sorbentu, myjąc go. Okresowo porcjami (impulsami) rozdzielana mieszanina jest wprowadzana do strumienia eluentu, po czym czysty eluent jest ponownie podawany. Podczas wymywania (elucji) składniki są rozdzielane,ponadto ich strefy koncentracji są oddzielone strefami eluentu.
Chromatografia eluentowa umożliwia niemal całkowite oddzielenie analizowanej mieszaniny substancji, a mieszanina może być wieloskładnikowa. Do zalet tej metody należy również izolacja składników od siebie oraz prostota analizy ilościowej mieszaniny. Wady to wysokie zużycie eluentu i niskie stężenie w nim składników próbki po separacji na wylocie kolumny. Metoda eluentu jest szeroko stosowana zarówno w chromatografii gazowej, jak i cieczowej.
Procesy chromatograficzne w zależności od celu
Różnica celów chromatograficznych umożliwia rozróżnienie metod takich jak analityczne, preparatywne i przemysłowe.
Za pomocą chromatografii analitycznej przeprowadzana jest analiza jakościowa i ilościowa mieszanin. Analizując składniki próbki, opuszczając kolumnę chromatografu trafiają one do detektora - urządzenia wrażliwego na zmiany stężenia substancji w eluencie. Czas upływający od momentu wprowadzenia próbki do kolumny do momentu maksymalnego stężenia piku substancji na detektorze nazywany jest czasem retencji. Zakładając, że temperatura kolumny i szybkość eluentu są stałe, wartość ta jest stała dla każdej substancji i służy jako podstawa do analizy jakościowej mieszaniny. Analizę ilościową przeprowadza się poprzez pomiar powierzchni poszczególnych pików na chromatogramie. Z reguły metoda eluentu stosowana jest w chromatografii analitycznej.
Chromatografia przygotowawcza ma na celu wyizolowanie czystych substancji z mieszaniny. Kolumny przygotowawcze mają znacznie więksześrednica niż analityczna.
Chromatografia przemysłowa służy przede wszystkim do uzyskania dużych ilości czystych substancji potrzebnych w konkretnej produkcji. Po drugie stanowi ważną część nowoczesnych systemów sterowania i regulacji procesów technologicznych.
Chromatograf przemysłowy posiada skalę stężeń jednego lub drugiego składnika i jest wyposażony w czujnik oraz systemy kontroli i rejestracji. Próbki są dostarczane do takich chromatografów automatycznie z określoną częstotliwością.
Wielofunkcyjny sprzęt do chromatografii
Nowoczesne chromatografy to złożone, zaawansowane technologicznie urządzenia, które mogą być używane w różnych dziedzinach i do różnych celów. Urządzenia te umożliwiają analizę złożonych mieszanin wieloskładnikowych. Wyposażone są w szeroką gamę detektorów: termokonduktometrycznych, optycznych, jonizacyjnych, spektrometrycznych mas itd.
Ponadto nowoczesna chromatografia wykorzystuje automatyczne systemy kontroli do analizy i przetwarzania chromatogramów. Sterowanie może odbywać się z komputera lub bezpośrednio z urządzenia.
Przykładem takiego urządzenia jest wielofunkcyjny chromatograf gazowy „Crystal 5000”. Posiada zestaw czterech wymiennych detektorów, termostat kolumnowy, elektroniczne systemy kontroli ciśnienia i przepływu oraz sterowanie zaworami gazowymi. Aby rozwiązać różne problemy, urządzenie mamożliwość montażu zarówno kolumn wypełnionych jak i kapilarnych.
Chromatograf jest sterowany za pomocą w pełni funkcjonalnej klawiatury i wyświetlacza kontrolnego lub (w innej modyfikacji) z komputera osobistego. To urządzenie nowej generacji może być skutecznie wykorzystywane w produkcji oraz w różnych laboratoriach badawczych: medycznych, kryminalistycznych, środowiskowych.
Chromatografia wysokociśnieniowa
Przeprowadzanie cieczowej chromatografii kolumnowej charakteryzuje się dość długim czasem trwania procesu. W celu przyspieszenia ruchu ciekłego eluentu wykorzystuje się doprowadzenie fazy ruchomej do kolumny pod ciśnieniem. Ta nowoczesna i bardzo obiecująca metoda nazywana jest metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
System pompowania chromatografu cieczowego HPLC dostarcza eluent ze stałą szybkością. Rozwinięte ciśnienie wlotowe może osiągnąć 40 MPa. Sterowanie komputerowe umożliwia zmianę składu fazy ruchomej zgodnie z zadanym programem (ta metoda elucji nazywana jest gradientem).
HPLC można stosować różne metody oparte na naturze interakcji sorbentu i sorbatu: dystrybucja, adsorpcja, wykluczenie wielkości, chromatografia jonowymienna. Najpopularniejszym typem HPLC jest metoda z odwróconą fazą, oparta na hydrofobowym oddziaływaniu polarnej (wodnej) fazy ruchomej i niepolarnego sorbentu, takiego jak żel krzemionkowy.
Metoda jest szeroko stosowana do separacji, analizy,kontrola jakości nielotnych, niestabilnych termicznie substancji, których nie można przekształcić w stan gazowy. Są to agrochemikalia, leki, składniki żywności i inne złożone substancje.
Znaczenie badań chromatograficznych
Różne rodzaje chromatografii są szeroko stosowane w różnych dziedzinach:
- chemia nieorganiczna;
- petrochemia i górnictwo;
- biochemia;
- medycyna i farmaceutyki;
- przemysł spożywczy;
- ekologia;
- kryminologia.
Ta lista jest niekompletna, ale odzwierciedla zakres branż, które nie mogą obejść się bez chromatograficznych metod analizy, rozdzielania i oczyszczania substancji. We wszystkich obszarach zastosowania chromatografii, od laboratoriów naukowych po produkcję przemysłową, rola tych metod wzrasta jeszcze bardziej wraz z wprowadzaniem nowoczesnych technologii przetwarzania informacji, zarządzania i kontroli złożonych procesów.
