Co leży u podstaw hybrydyzacji DNA? Chociaż sekwencja dwuniciowego DNA jest ogólnie stabilna w warunkach fizjologicznych, zmiana tych warunków w laboratorium (zwykle poprzez podniesienie temperatury otoczenia) spowoduje, że cząsteczki rozdzielą się na pojedyncze nici. Te ostatnie są względem siebie komplementarne, ale mogą również uzupełniać inne sekwencje obecne w ich środowisku. Obniżenie temperatury otoczenia pozwala jednoniciowym cząsteczkom na hybrydyzację lub „hybrydyzację” ze sobą. To jest metoda hybrydyzacji DNA.
Koncepcja z punktu widzenia biologii molekularnej
Naukowcy zaangażowani zarówno w replikację DNA, jak i transkrypcję DNA do RNA polegają na krzyżowaniu nukleotydów i technikach biologii molekularnej. Obejmuje to analizę Southern i Northern, reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) oraz większość metod hybrydyzacji i sekwencjonowania DNA-RNA.
Aplikacja
Hybrydyzacja jest główną właściwością nukleotydówsekwencje i jest stosowany w wielu metodach biologii molekularnej. Ogólny związek genetyczny dwóch gatunków można określić przez hybrydyzację segmentów ich DNA (hybrydyzacja DNA-DNA). Ze względu na podobieństwa sekwencji między blisko spokrewnionymi organizmami, do stopienia takich hybryd DNA wymagana jest wyższa temperatura w porównaniu z organizmami bardziej odległymi. Różne metody wykorzystują hybrydyzację do określenia pochodzenia próbki DNA, w tym reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). W innej metodzie krótkie sekwencje DNA są hybrydyzowane z komórkowym mRNA w celu zidentyfikowania eksprymowanych genów. Firmy farmaceutyczne badają zastosowanie antysensownego RNA do wiązania się z niechcianym mRNA, zapobiegając translacji mRNA przez rybosom na białko.
Hybrydyzacja DNA-DNA ogólnie odnosi się do techniki biologii molekularnej, która mierzy stopień podobieństwa genetycznego między pulami sekwencji DNA. Jest powszechnie używany do określenia dystansu genetycznego między dwoma organizmami. Jest szeroko stosowany w filogenezie i taksonomii.
Metodologia
DNA z jednego organizmu zostało oznakowane, a następnie zmieszane z nieoznakowanym DNA, które można z nim porównać. Mieszaninę inkubuje się, aby umożliwić rozdzielenie nici DNA, a następnie schłodzić w celu utworzenia zregenerowanego hybrydowego dwuniciowego DNA. Zhybrydyzowane sekwencje o wysokim stopniu podobieństwa będą wiązać się ściślej i będą wymagały więcej energii, aby je oddzielić: tj. rozdzielają się po podgrzaniu w wyższymtemperatura niż różne sekwencje, proces znany jako „topienie DNA”.
topienie DNA
Oceniając profil topnienia zhybrydyzowanego DNA, dwuniciowy DNA wiąże się z tak zwaną „kolumną”, a powstałą mieszaninę ogrzewa się. Na każdym etapie kolumna jest płukana, a topiące się sekwencje DNA stają się jednoniciowe i są wypłukiwane z kolumny. Temperatury, w których znakowany DNA opuszcza kolumnę, odzwierciedla stopień podobieństwa między sekwencjami (a wzór samofałdowania służy jako kontrola). Wyniki te są łączone w celu określenia stopnia podobieństwa genetycznego między organizmami. Według współczesnej mikrobiologii hybrydyzacja DNA jest niemożliwa bez zrozumienia tych rzeczy.
Gdy porównuje się w ten sposób wiele gatunków kwasu rybonukleinowego (lub dezoksyrybonukleinowego), wartości podobieństwa pozwalają na umieszczenie gatunku w drzewie filogenetycznym. Dlatego jest to jedno z możliwych podejść do prowadzenia systematyki molekularnej. Charles Sibley i John Ahlquist, pionierzy tej techniki, wykorzystali hybrydyzację DNA-DNA do badania powiązań filogenetycznych ptaków (taksonomia Sibley-Ahlquist) i naczelnych.
Ważność dla biologii
Hybrydyzacja DNA-DNA jest złotym standardem rozróżniania gatunków bakterii, z wartością podobieństwa przekraczającą 70%, co wskazuje, że porównywane szczepy należą do różnych gatunków. W 2014 r. dla wyodrębnienia podgatunku bakterii zaproponowano próg 79% podobieństwa.
Krytycy twierdzą, że ta technika jest niedokładna do porównywania blisko spokrewnionych gatunków, ponieważ każda próba pomiaru różnic między sekwencjami ortologicznymi między organizmami jest przytłaczana przez hybrydyzację paralogicznych odpowiedników w genomie organizmu. Sekwencjonowanie DNA i porównania sekwencji obliczeniowych są obecnie powszechnie stosowaną metodą określania dystansu genetycznego, chociaż podejście to jest nadal stosowane w mikrobiologii, aby pomóc w identyfikacji bakterii.
Obecnym sposobem jest przeprowadzenie hybrydyzacji DNA-DNA w silikonie przy użyciu całkowicie lub częściowo zsekwencjonowanych genomów. GGDC opracowany przez DSMZ jest najdokładniejszym znanym narzędziem do obliczania wartości podobnych do DDH. Wśród innych ulepszeń algorytmicznych rozwiązuje problem z sekwencjami paralogicznymi, starannie odfiltrowując je z dopasowań między dwiema sekwencjami genomowymi.
metoda RYBA
Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) to technika laboratoryjna używana do wykrywania i sekwencjonowania DNA, często na określonym chromosomie.
W 1969 Joseph Gall i Mary Lou Pardu opublikowali artykuł wykazujący, że radioaktywne kopie rybosomalnej sekwencji DNA mogą być użyte do wykrywania komplementarnych sekwencji DNA w jądrze jaja żaby. Od czasu tych oryginalnych obserwacji wiele udoskonaleń zwiększyło wszechstronność i…czułość procedury do tego stopnia, że hybrydyzacja in situ („na miejscu”, łac.) jest obecnie uważana za ważne narzędzie w cytogenetyce. (Termin in situ jest obecnie używany również w odniesieniu do początkowego stadium wzrostu raka, kiedy w patologicznym procesie zaangażowana jest tylko tkanka nabłonkowa.)
Sekwencja hybrydyzacji fluorescencyjnej
Sonda RNA może być zaprojektowana dla dowolnego genu lub dowolnej sekwencji w genie w celu wizualizacji mRNA lncRNA i miRNA w tkankach i komórkach. FISH służy do badania cyklu reprodukcji komórek, w szczególności interfazy jądrowej pod kątem wszelkich nieprawidłowości chromosomalnych. FISH pozwala na analizę dużej serii przypadków archiwalnych, znacznie łatwiej jest zidentyfikować zidentyfikowany chromosom, tworząc sondę ze sztuczną podstawą chromosomu, która będzie przyciągać podobne chromosomy.
Sygnały hybrydyzacji dla każdej sondy po wykryciu nieprawidłowości jądra: każda sonda do wykrywania mRNA i lncRNA składa się z 20 par oligonukleotydów, każda para zajmuje przestrzeń 40-50 pz. p. Sondy wykorzystują zastrzeżoną chemię do wykrywania mRNA.
Hybrydyzacja z sondami DNA
Sondy są często wykonane z fragmentów DNA, które zostały wyizolowane, oczyszczone i wzmocnione do wykorzystania w projektowaniu ludzkiego genomu. Wielkość genomu ludzkiego jest tak duża w porównaniu z długością, którą można bezpośrednio zsekwencjonować, że konieczne jest podzielenie go napaprochy. Ostatecznie, te fragmenty zostały uporządkowane poprzez trawienie kopii każdego fragmentu na jeszcze mniejsze jednostki przy użyciu endonukleaz specyficznych dla sekwencji w celu zmierzenia wielkości każdego małego fragmentu przy użyciu chromatografii wykluczania z wykorzystaniem tych informacji w celu określenia, gdzie duże fragmenty nakładają się na siebie.
Aby zachować elementy z ich indywidualnymi sekwencjami DNA, fragmenty zostały dodane do systemu stale powtarzających się populacji bakterii. Populacje klonalne bakterii, z których każda utrzymuje jeden sztuczny chromosom, są przechowywane w różnych laboratoriach na całym świecie. Sztuczne chromosomy (BAC) można hodować, ekstrahować i znakować w dowolnym laboratorium zawierającym bibliotekę. Biblioteki genomowe są często nazywane po instytucjach, w których powstały. Przykładem jest biblioteka RPCI-11, nazwana na cześć Roswell Cancer Institute w Buffalo (Nowy Jork, USA). Fragmenty te tworzą około 100 tysięcy par zasad i są podstawą większości sond FISH.
